四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖凋亡与分化作用的研究Word下载.docx

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PE标记的磷酸化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体购自Bioscience公司；

hTERT-mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由Roche公司提供。

　　细胞培养

　　NB4细胞株引自浙江大学血液病研究所。

采用含10%的小牛血清的RPMI1640并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸及青霉素和链霉素（100μg/ml）的培养体系培养。

培养环境为37℃、5%的CO2培养箱。

取对数生长期的细胞进行实验。

　　细胞活率、细胞计数和形态观察

　　以2×

105/ml的细胞浓度，分别接种于含9种浓度不同的ZGDHu-1的培养液中，并设10μg/ml的ATRA作为阳性对照组和不加药物的空白对照组，每瓶含5ml。

培养24、48和72小时，计数各组细胞数，计算细胞增殖抑制率,用4%台盼蓝染色，计数活细胞数。

每次每瓶计数3次，实验重复3次，绘制细胞增殖和活力曲线。

取药物作用后各组的细胞先在倒置显微镜下观察，再将细胞悬液离心涂片，用Wright-Giemsa染色，光镜下观察细胞形态变化。

　　ZGDHu-1对NB4细胞生长影响的MTT测定

　　调整细胞浓度为5×

104/ml，接种于96孔无菌培养板中，每孔200μl。

实验组、阳性对照组和空白组的设置同细胞活率和计数测定。

每组每个浓度下设3个复孔，实验重复3次。

培养24、48和72小时后用MTT法读取吸光度值，计算抑制率并绘制剂量效应曲线，求出ZGDHu-1对NB4细胞的半数抑制浓度（IC50）。

　　凋亡细胞的AnnexinV/PI标记染色测定

　　调整细胞浓度2×

105/ml的，分别接种于含6种不同ZGDHu-1浓度的培养液中，并设10μg/ml的ATRA作为阳性对照组和不加药物的空白对照组，每瓶含5ml。

培养12小时后轻轻收获细胞1×

106个，用冷PBS洗1遍后置0℃水浴中，加490μl结合缓冲液，轻轻混匀后加5μlFITC-AnnexinV和5μlPI，10分钟后用流式细胞仪检测。

　　细胞周期和DNA倍体分析

　　分组方法同AnnexinV/PI标记，培养48小时后，取培养细胞悬液ml，用冷PBS各洗涤1次，加DNA-Prepkit中透膜液50μl,轻摇后放置1分钟，加碘化丙锭染液500μl作用15分钟后，在EPICS-XL型流式细胞仪上分析，检测104以上个细胞，并用Muticycle软件进行DNA倍体及细胞周期分析，计算亚二倍体峰（subG1）的百分率。

　　DNA琼脂糖凝胶电泳

　　收获经ZGDHu-1作用48小时的NB4细胞1×

107个，用SDS和蛋白酶K裂解细胞后，按照常规方法用酚一氯仿提取DNA，复溶于TE缓冲液中，经溴乙锭染色后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳，5V/cm,电泳3-4小时，在紫外线透射仪上显影拍照。

　　NBT还原试验

　　取经ZGDHu-1作用后的NB4细胞500μl，与2g/L的NBT溶液混合，加入100μg/mlTPA10μl，37℃孵育30分钟后离心涂片，光学显微镜下观察胞浆内含蓝灰色颗粒的阳性细胞。

计数200个细胞，得出NBT阳性细胞的百分率。

　　细胞表面分化抗原检测

　　取经药物作用后的细胞，用PBS洗涤1次后，调整细胞浓度为106/ml，用CD11b、、CD13单克隆抗体对各组细胞进行免疫标记，用流式细胞仪检测细胞CD11b、CD13的抗原表达。

　　bcl-2、bax基因的表达分析

　　收集药物作用的细胞，用PBS洗涤1次后调整细胞悬液浓度为5×

106/ml，细胞悬液再用PBS洗涤，每管加100μl细胞悬液，加透膜剂I100μl，室温放置15分钟后用PBS洗1遍，再加透膜剂Ⅱ100μl，轻摇。

5分钟后各加bcl-2、bax和同型对照20μl，室温放置20分钟后用PBS洗2次，加PE标记的第二抗体，室温暗处放置20分钟后用PBS洗1次，将细胞悬于mlPBSF中。

用流式细胞仪检测阳性细胞百分率。

　　hTERT-mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR法检测

　　收集经ZGDHu-1作用的NB4细胞，以TRIZOL一步法按照说明书提取各组细胞的总RNA。

检测时设加逆转录酶的测定管、不加逆转录酶的空白管和以PBGD为内参照的对照管。

每批检测时同时测定hTERT-mRNR和PBGD的阴的、阳性对照及标准曲线。

PCR反应体系为20μl，内含有10×

反应缓冲液2μl，逆转录酶μl，10×

hTERT或PBGD反应测定应液2μl，PCR级蒸馏水μl，RNA提取物2μl。

按试剂盒说明书在LightCycler荧光PCR仪上设置反应程序。

结果以/内对照管的比值表示。

　　磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3表达的检测

　　收集经ZGDHu-1处理后的NB4细胞，用PBS洗1次，并调整细胞浓度约为106/ml。

用2%多聚甲醛/PBS溶液于37℃固定10分钟，离心后弃上层液；

用90%的甲醇作细胞透膜，冰浴30分钟；

再用PBS洗细胞2次。

经上述处理后的细胞悬液各100μl分别用PE标记的磷酸化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体20μl染色，室温避光放置60分钟后在流式细胞仪上分析。

　　统计学分析

　　实验数据用均数±

标准差表示，采用SPSS，forwindows统计软件，作F检验比较。

　　结果

　　ZGDHu-1对NB4细胞增殖及活力的影响

　　不同浓度的ZGDHu-1对NB4细胞的增殖均有抑制作用，呈现剂量-时间依赖关系。

表1说明50ng/ml的ZGDHu-1即可显着抑制NB4细胞的生长。

48和72小时的IC50分别为450和200ng/ml。

　　NB4细胞经ZGDHu-1作用后，随着作用剂量和时间的增加，细胞增殖明显受抑，细胞活率显着减少，呈现剂量和时间的量效关系。

Table1.EffectofZGDHU-1onproliferationofNB4cells

　　ZGDHu-1对NB4细胞诱导分化作用

　　细胞形态学观察NB4细胞经50ng/mlZGDHu-1作用3天后，光学显微镜下显示细胞开始发生分化，表现为细胞体积缩小，细胞核也明显缩小，核仁消失，染色质缩增粗，胞浆增多，出现少量颗粒，核浆比例缩小，核偏于一侧，有凹陷和分叶（图3）。

　　NBT试验NB4细胞与2、10、50、100ng/mlZGDHu-1共同培养3天后，NBT的还原率随药物浓度递升而增加，各实验组和ATRA对照组结果均显着高于空白对照组。

Table2.ResultsofNBTandCD11b,CD13ofNB4cellsaftertreatmentwithdifferentconcentrationsofZGDHU-1

　　细胞表面分化抗原的改变NB4细胞与ZGDHu-1共同培养3天后，细胞表面分化抗原检测显示,CD11b和CD13的表达明显高于空白对照组，提示ZGDHu-1能诱导NB4细胞向成熟细胞分化。

　　ZGDHu-1对NB4细胞的诱导凋亡作用

　　细胞形态学观察倒置显微镜下，空白对照组NB4细胞形态均一，可成簇生长。

经ZGDHu-处理的NB4细胞皱缩变小，大小不一，出现细胞碎裂，未见细胞成簇生长。

经Wright-Giemsa染色后油镜下观察，细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂，胞膜出泡，并可见典型的凋亡小体等。

经Hoechst33258荧光染色后，在荧光显微镜下凋亡细胞可见细胞核或细胞质内浓染致密的颗粒荧光，正常细胞核呈弥漫均匀的荧光。

　　细胞周期及DNA倍体分析ZGDHu-1与NB4细胞培养48小时后，细胞周期及DNA倍体分析显示，细胞凋亡率与药物剂量存在着显着的量效关系。

细胞周期进程明显受影响，G0/1期细胞减少，细胞阻滞在G2-M期，但随药物作用时间延长，G2-M细胞百分比有所减少；

提示ZGDHu-1诱导G0/1细胞凋亡并阻止细胞分裂。

DNA琼脂糖凝胶电泳检测NB4细胞与不同浓度的ZGDHu-1孵育48小时后，经琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的凋亡细胞特征性的梯状条带。

对照组无DNA梯状条带出现。

Table3.ApoptosisandcellcycleofNB4cellsaftertreatmentwithdifferentconcentrationofZGDHU-1

　　凋亡细胞的AnnexinV/PI双标记测定

　　NB4细胞和不同浓度（2、10、50、100、200、500ng/ml）的ZGDHu-1作用12小时后，早期凋亡细胞分别为%、%、%、%、%和%，ATRA组为%，对照组为%。

细胞总凋亡率分别为%、%、1975%、%、和%，ATRA组为923%，对照组为%（图7）。

　　ZGDHU-1对NB4细胞增殖、分化和凋亡相关调控基因表达的影响

　　bcl-2和bax基因的表达NB4细胞经不同浓度（2、10、50、100、200、500ng/ml）的ZGDHu-1作用24小时后，bcl-2的表达依次为%、%、%、%、%、%，空白对照为%。

两组间表达无明显变化。

bax的表达分别为%、136%、%、%、%、%，空白对照为%。

经ZGDHU-1作用后，bax的表达显着增加。

bax/bcl-2的比值依次为、、、858、、，对照组为。

　　P38MAPK和STAT3磷酸化表达的变化NB4细胞经不同浓度的ZGDHu-1培养48小时后，磷酸化P38MAPK随ZGDHu-1浓度增高出现表达增强，而磷酸化STAT3表达无变化，前者分别为%、157%、%、%、%、%，对照组为428%；

后者分别为%、%、%、%、%、%，对照组为%。

　　对hTERT-mRNA表达的影响NB4细胞经不同浓度的ZGDHu-1培养48小时后，hTERT-mRNA表达水平逐渐下降，hTERT/PBGD的比值依次为、、、、、，空白对照为。

　　讨论

　　本研究表明，ZGDHu-1可抑制NB4细胞增殖，其抑制效应呈时间和剂量依赖性。

50ng/mlZGDHu-1即可显着抑制NB4细胞生长，500ng/mlZGDHu-1对NB4细胞的抑制率与10μg/mlATRA相似，抑制效率是ATRA的20倍。

细胞增殖率和细胞活率测定结果显示，不同浓度的ZGDHu-1与NB4细胞培养24-72小时后，细胞增殖率和活率呈现药物剂量和作用时间依赖性下降。

此结果表明NB4细胞经ZGDHu-1处理后，细胞增殖能力显着减弱。

ZGDHu-1抑制NB4细胞生长的周期与ATRA有所不同。

细胞周期分析表明，经药物作用后，NB4细胞周期进程明显受影响，G0/1期细胞减少，S期细胞比例也降低，细胞阻滞在G2-M期，但随药物作用时间延长，G2-M细胞百分比有所减少。

这提示ZGDHu-1是通过阻止NB4细胞分裂而抑制其增殖。

我们的实验结果显示，ZGDHu-1抑制NB4细胞增殖的同时，在低浓度时可以诱导分化，在较高浓度时则可以促使细胞凋亡。

本研究采用浓度梯度为2-500ng/ml的ZGDHu-1与NB4细胞作用不同的时间后，测定亚G1期细胞百分率，结果发现随着药物浓度的增加，亚G1期细胞百分率也随之增加，显着高于对照组，呈剂量效应关系，100ng/mlZGDHu-1诱导NB4的凋亡率与10μg/mlATRA相似。

AnnexinV/PI双标记染色测定凋亡细胞显示，NB4细胞经ZGDHu-1作用24小时之后，细胞早期凋亡率和总凋亡率随ZGDHu-1浓度的增加而升高，10ng/mlZGDHu-1诱导NB4早期凋亡率与10μg/mlATRA相似，说明ZGDHu-1诱导NB4凋亡效果显着高于ATRA且诱导时间也明显提早。

ZGDHu-1与NB4细胞作用48小时之后，光学显微镜下可见细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂，胞膜出泡，新月型核等凋亡细胞的特征性改变。

Hoechst33258荧光染色后，在荧光显微镜下可见细胞核或细胞质内浓染致密的颗粒荧光。

经DNA琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的凋亡细胞特征性的梯状条带。

上述结果说明，ZGDHu-1可诱导NB4细胞凋亡。

NB4细胞经2-50ng/mlZGDHu-1作用3天后，光学显微镜下观察细胞细胞体积缩小，细胞核也明显缩小，核仁消失，染色质缩增粗，胞浆增多，核浆比例缩小，核偏于一侧，有凹陷和分叶。

NBT的还原率显着增高，细胞表面分化抗原检测，CD11b、CD13表达明显增加，提示ZGDHu-1能诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞向成熟粒细胞分化。

有作者研究替莫唑胺的作用机制时，认为可能与DNA特定位置的甲基化有关［5］，还可能与抑制端粒酶活性有关［6］。

bcl-2和bax是Bcl-2家族中最主要的两个成员，分别具有抑制和促进细胞凋亡的作用，其彼此间的比例决定了细胞的增殖和凋亡。

本研究发现,ZGDHu-1诱导NB4细胞增殖、分化和凋亡过程中，bcl-2表达无明显变化，但bax的表达显着增加，bax/bcl-2的比值也随之增加。

P38MAPK可被多种因子和环境应激反应激活，介导细胞增殖、分化和凋亡［7］。

P38MAPK磷酸化后可激活P53蛋白，阻断P38MAPK磷酸化可以抑制p53基因的转录激活［8］。

STAT3也可调节细胞的生长、分化、恶性转化和凋亡［9］，其C-末端Y705酪氨酸磷酸化是STAT3活化的标志，具有加速细胞周循环，促进细胞转化，抑制凋亡的作用。

本研究观察了ZGDHu-1诱导NB4细胞分化和凋亡过程中P38MAPK和STAT3磷酸化表达的变化,发现NB4细胞经不同浓度的ZGDHu-1培养48小时后，磷酸化P38MAPK随ZGDHu-1浓度增高表达增强，而磷酸化STAT3表达无变化，说明P38MAPK信号通路参与了ZGDHu-1诱导NB4细胞分化和凋亡过程。

以端粒酶为治疗靶点是抗肿瘤的研究热点。

hTERT作为端粒酶的催化亚单位，被认为是端粒酶的主要功能单位，与肿瘤细胞永生化的关系最密切。

本研究用荧光实时定量RT-PCR检测了ZGDHu-1诱导NB4细胞凋亡过程中hTERT-mRNA的变化规律，发现随ZGDHu-1作用剂量增加，NB4细胞凋亡也显着增加的同时，hTERT-mRNA的表达水平呈明显下降趋势，表现为剂量的量效关系。

推测ZGDHu-1也可以通过抑制端粒酶活性使NB4细胞发生凋亡，端粒酶可能是ZGDHu-1抗肿瘤的分子机制之一。

本研究表明，ZGDHu-1可以抑制NB4细胞增殖，低浓度时可诱导其分化，在高浓度时可促进凋亡。

此过程中伴随bax表达增加和bax/bcl-2比值升高，磷酸化P38MAPK表达增强和hTERT-mRNA表达抑制。

因此，ZGDHu-1有望成为能够治疗白血病的一种新药。

【参考文献】

　　1胡惟孝，杨忠愚，周茂等。

新型抗癌药3,6-二甲基-1,4-二氢-S-四嗪-1,4-二甲酰胺类化合物及其制造方法.中国发明专利,申请号，证书号第159831号

　　2孙雅泉，袁庆，杨忠愚等.N,N＇-双间甲苯基-3，6-二甲基-1，4二氢-1，2，4，5-四嗪-1，4-二甲酰胺的合成和晶体结构。

有机化学，2003；

23：

483-487

　　3蔡志彬，周茂，胡惟孝等.N,N＇-二取代苯基-3，6-二甲基-1，4二氢-1，2，4，5-四嗪-1，4-二甲酰胺衍生物的合成及抗肿瘤活性.药学学报，2000；

35：

793-796

　　4HuWX,RaoGW,SunYQ.Synthesisandantitumoractivityofs-tetrazinederivatives.BioorgMedChemLett,2004;

14:

1177-1181

　　5WedgeSR,NewlandsES.O6-benzylguanineenhancesthesensitivityofagliomaxenograftwithlowO6-alkyguanine-DNAalkyltransferaseactivitytotemozolomideandBCNU.BrJCancer,1996;

73:

1049-1052

　　6KanzawaT,GermanoIM,KondoY,etal.Inhibitionoftelomeraseactivityinmalignantgliomacellscorrelationwiththeirsensitivitytotemozolomide.BrJCancer,2003;

89:

922-929

　　7SegerR,KrebsEG.TheMAPKsignalingcascade.FASEBJ,1995;

9:

726-735

　　8Sanchez-PrirtoR,RojasJM,TayaY,etal.Aroleorthep38mitogenactivatedproteinkinasepathwayinthetranscriptionalactivationofp53ongenotoxicstressbychemotherapeuticagents.CancerRes,2000;

60:

2464-2470.