实验室微生物鉴定常见生化反映及应用价值.docx

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实验室微生物鉴定常见生化反映及应用价值

实验室微生物鉴定常见生化反映及应用价值

明胶液化实验

（1）原理：

某些能够产生一种胞外蛋白水解酶（明胶酶），能使明胶分解为氨基酸，使明胶失去凝固能力而液化，因此使半固体的明胶培育基成为流动的液体。

（2）方式：

将待检菌接种于明胶培育基中，22℃培育7d或更长时刻，天天观看结果有无凝固。

　　（3）结果：

如无凝固，那么表示明胶已被水解，液化实验阳性。

如凝固，那么继续培育。

　　（4）应用：

肠杆菌科细菌的辨别，如奇异变形杆菌、一般变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。

有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。

另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化

吲哚实验（靛基质实验）

（1）原理：

某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）后那么形成红色的玫瑰吲哚。

（2）培育基：

蛋白胨水培育基。

　　（3）方式：

将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培育基中，35℃孵育24~48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂，观看结果。

　　（4）结果：

于两液面接触处显现红色为阳性，无色为阴性。

　　（5）应用：

要紧用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的辨别。

硫化氢实验

（1）原理：

某些细菌能分解培育基中的含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇亚铁离子或铅离子那么结合形成黑色沉淀物（硫化铁或硫化铅沉淀）。

（2）培育基：

醋酸铅培育基。

　　（3）方式：

将待检菌穿刺接种于醋酸铅培育基中，于35℃孵育24h-48h，观看有无黑色沉淀显现。

　　（4）结果：

培育基变黑为阳性，不变成阴性。

　　（5）应用：

要紧用于辨别肠杆菌科中属及种的辨别，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。

但沙门菌属中亦有部份硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。

尿素分解实验

（1）原理：

某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培育基呈碱性。

（2）培育基：

尿素培育基。

　　（3）方式：

将待检菌接种于尿素培育基，于35℃孵育18~24h小时观看结果。

　　（4）结果：

培育基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变成阴性。

　　（5）应用：

要紧用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。

奇异变形杆菌和一般变形杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。

苯丙氨酸脱氨酶实验

（1）原理：

测定细菌是不是产生苯丙氨酸脱氨酶。

细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反映。

（2）培育基：

苯丙氨酸琼脂培育基。

　　（3）方式：

将待检菌大量接种入苯丙氨酸琼脂培育基中，35℃孵育18~24h，滴加10%三氯化铁试剂3~4滴，自斜面上方流下。

　　（4）结果：

有绿色显现为阳性。

应当即观看结果，延长反映时刻会引发褪色。

　　（5）应用：

要紧用于肠杆菌科细菌的鉴定。

变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。

氨基酸脱羧酶实验

（1）原理：

某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳。

由于胺的生成使培育基变成碱性，可用指示剂指示出来。

（2）培育基：

氨基酸脱羧酶培育基和氨基酸对照培育基。

　　（3）方式：

将待检菌别离接种于1支氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸）脱羧酶实验管和1支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35℃孵育1~4d，每日观看结果。

　　（4）结果：

对照管应为黄色，假设为溴甲酚紫指示剂，那么测定管呈紫色那么为阳性，假设测定管呈黄色为阴性。

假设对照管呈现紫色那么实验无心义，不能做出判定。

（5）应用：

要紧用于肠杆菌科细菌的辨别。

如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。

志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。

碳源和氮源利用实验

　　是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定实验。

　　在枸橼酸盐培育基中，细菌只有利用枸橼酸盐作为碳源，分解生成碳酸钠使培育基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变成深蓝色。

　　经常使用的实验方式有枸橼酸盐利用实验、丙二酸盐利用实验。

　枸橼酸盐利用实验

（1）原理：

某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培育基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培育基变碱性。

（2）培育基：

枸橼酸盐培育基。

　　（3）方式：

将待检菌接种于枸橼酸盐培育基上，置35℃孵育1~4d，逐日观看结果。

　　（4）结果：

假设用溴麝香草酚兰指示剂，斜面显现菌落或菌苔，培育基由淡蓝色变蓝色为阳性;不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培育基上不能生长，培育基不变色，仍为绿色为阴性。

　　（5）应用：

用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。

在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性。

丙二酸盐利用实验

（1）原理：

某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培育基变碱

（2）培育基：

丙二酸盐培育基。

　　（3）方式：

将待检菌接种于丙二酸盐培育基中，置35℃孵育24~48h，观看结果。

　　（4）结果：

培育基由淡绿色变成蓝色为阳性。

颜色无转变为阴性。

　　（5）应用：

肠杆菌科中属间及种的鉴定。

克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其它各菌属均为阴性。

氧化酶实验

（1）原理：

氧化酶（即细胞色素氧化酶），是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。

具有氧化酶的细菌，第一使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。

因此，本实验结果与细胞色素C的存在有关。

（2）方式：

　　1）菌落法：

直接滴加试剂于被检菌落上。

　　2）滤纸法：

取干净滤纸一小块，蘸取菌少量，然后加试剂。

　　3）试剂纸片法：

将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。

　　（3）结果：

细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。

无色为阴性。

为保证结果的准确性，别离以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。

　　（4）应用：

要紧用于肠杆菌科细菌和假单胞菌属的辨别，前者阴性，而后者阳性。

奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反映。

过氧化氢酶实验（触酶实验）

（1）原理：

具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，显现气泡。

（2）方式：

取干净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%过氧化氢数滴，当即观看结果。

　　（3）结果：

假设当即显现大量气泡为阳性。

无气泡为阴性。

　　（4）应用：

革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故该实验经常使用于革兰阳性球菌的初步分群。

硝酸盐还原实验

（1）原理：

硝酸盐还原反映包括两个进程：

一是在合成代谢进程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物;

二是在分解代谢进程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。

硝酸盐还原进程可因细菌不同而异。

有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等;有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵;有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如沙雷菌属;有的细菌还能够将其还原产物在合成性代谢中完全利用。

（2）培育基：

硝酸盐培育基。

　　（3）方式：

将待检菌接种于硝酸盐培育基（内含小倒管）中，35℃孵育1~4d。

将甲、乙等量混合液（历时混合）（约0.1ml）加于试管内，当即观看结果。

　　（4）结果：

显现红色为阳性反映。

假设加入试剂后无颜色反映，可能是：

①硝酸盐没有被还原，实验阴性;②硝酸盐被还原为氨和氮等其他物质而致使假阴性结果，这时应在试管内加入少量锌粉，如显现红色那么说明实验确实为阴性。

假设仍不产生红色，说明实验为假阴性。

　　假设要观看是不是有氮气产生，可于培育基管内加1只小导管，有气泡产生，那么表示有氮气生成。

　　（5）应用：

本实验普遍用于细菌鉴定。

肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐;铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌属都可产生氮气;有些厌氧菌如韦荣菌等实验也为阳性。

脂酶实验

（1）原理：

有些细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。

在培育基中加入维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，若是脂肪被分解，那么维多利亚蓝被释放出来，呈现深蓝色。

（2）培育基：

含维多利亚蓝的脂酶培育基。

　　（3）方式：

将待检菌接种于含维多利亚蓝的脂酶培育基中，置37℃孵育24h，观看结果。

　　（4）结果：

培育基变成深蓝色者为阳性，阴性为无色或粉红色。

　　（5）应用：

要紧用于厌氧菌鉴定。

在类杆菌中的中间类杆菌产生脂酶，其它类杆菌阴性;在芽孢梭菌属中产芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也产生此酶，而其它梭菌为阴性。

卵磷脂酶实验

（1）原理：

有的细菌产生卵磷脂酶（α-毒素），经钙离子作用，能迅速分解卵磷脂，形成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。

（2）培育基：

1%卵黄琼脂平板。

　　（3）方式：

取待检菌划线接种或点种在卵黄琼脂平板上，置35℃孵育3~6h，观看结果。

　　（4）结果：

3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为卵磷脂酶实验阳性，6h后该混浊圈可扩大到直径5~6mm。

　　（5）应用：

该实验要紧用于厌氧菌的鉴定。

产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。

蜡样芽孢杆菌亦为阳性。

凝固酶实验

（1）原理：

凝固酶实验是鉴定葡萄球菌致病性的重要实验。

致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使其变成纤维蛋白，发生凝集，包围于细菌外面而凝聚成块，可用玻片法测出;另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。

（2）方式：

　　①玻片法：

取兔血浆和盐水各一滴，别离置于干净的玻片中央，用接种环取待检菌别离与血浆和盐水混合。

　　②试管法：

取试管2支，各加0.5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌别离加入血浆中并均匀，置37℃水浴3-4小时，每30min观看1次结果。

　　（3）结果：

　　①玻片法：

以血浆中有明显的颗粒显现而盐水中无自凝现象为阳性。

　　②试管法：

如有凝块或整管凝集显现为阳性。

2h后无上述现象显现，那么放置留宿后再观看。

　　（4）应用：

凝固酶实验是鉴定葡萄球菌致病性的重要实验，也是葡萄球辨别时经常使用的实验。

CAMP实验

（1）原理：

B群链球菌（无乳链球菌）产生一种“CAMP”因子，可增进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞的活性。

因此，可在两种细菌（B群链球菌和葡萄球菌）的交壤处溶血力增强，显现半月型透明溶血区。

（2）培育基：

血琼脂平板。

　　（3）方式：

在羊血或马血琼脂平板上，先以产β-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种。

再将待检菌与前一划线作垂直接种，二者不能相交，应相距0.5-1cm，于35℃孵育18~24h，观看结果。

每次实验应做阴阳性对照。

　　（4）结果：

两种细菌划线交接处显现箭头型溶血区为阳性。

　　（5）应用：

在链球菌中，只有B群链球菌CAMP实验阳性，故可作为特异性鉴定。

其他链球菌均为阴性。

胆汁溶菌实验

（1）原理：

胆汁或去氧胆酸钠能致使某些细菌溶解，一方面是由于胆汁或去氧胆酸钠降低了细菌细胞膜上的表面张力，使细菌的细胞膜破损或使菌体裂解。

另一方面可能是由于胆汁激活细菌体内的自溶酶，加速了细菌的自溶。

（2）方式：

　　①试管法：

用纯培育物制备1.8ml生理盐水浓菌悬液，pH调至7.0，分装两支试管，各0.9ml。

其中一管加10%去氧胆酸钠为实验管，另一管加0.5ml生理盐水作对照。

35℃孵育10-30分钟，观看结果。

　　②平板法：

在血平板上选取单个可疑菌落，作好标记，直接在菌落上加1接种环10%去氧胆酸钠（pH7.0），置35℃孵育30min（平板不要翻转）观看结果。

　　（3）结果：

　　①试管法：

以“加胆盐的培育物透明，而对照管仍混浊”为阳性。

　　②平板法：

如菌落消失，仅留下溶血区为阳性，菌落不消失为阴性。

　　（4）应用：

要紧用于肺炎链球菌与甲型链球菌的鉴定，前者卫阳性，后者为阴性。

O/129抑菌实验

（1）原理：

O/129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用。

（2）碱性琼脂平板。

　　（3）方式：

用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将O/129诊断纸片（含药40μg/片）贴于平板上，置35℃孵育18~24h，观看结果。

　　（4）结果：

显现抑菌环为灵敏，无抑菌环者为耐药。

　　（5）应用：

要紧用于弧菌科的属间辨别，弧菌属和邻单胞菌属菌为灵敏，气单胞菌属菌为耐药。

杆菌肽实验

（4）结果：

抑菌环直径大于10mm为灵敏，抑菌环直径小于10mm为耐药。

　（5）应用：

要紧用于A群链球菌与非A群链球菌的辨别。

DNA酶实验

（1）原理：

某些细菌能产生DNA酶，可使长链DNA水解成为寡核苷酸链。

因为长链DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸那么溶于酸。

故在DNA琼脂平板上加盐酸后，可在菌落周围形成透明环。

（2）培育基：

0.2%DNA琼脂平板。

　　（3）方式：

在DNA琼脂平板上点种待检菌，35℃孵育18~24h，用1mol/L盐酸倾注平板，观看结果。

　　（4）结果：

如菌落周围有透明环者为阳性，无透明环为阴性。

　　（5）应用：

要紧用于肠杆菌科及葡萄球菌属某些菌种的鉴定。

在G+球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷菌、变形杆菌产生DNA酶，均为阳性。

奥普托欣（Optochin）实验

（1）原理：

Optochin（奥普托欣）是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。

对肺炎链球菌有特异抑制作用，几乎所有肺炎链球菌对Optochin灵敏，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌那么无此作用。

（2）培育基：

血琼脂平板。

　　（3）方式：

用棉拭子将待检菌的肉汤培育物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上一张含5μg/片奥普托欣纸片，35℃孵育18~24h，观看结果。

　　（4）结果：

抑菌环直径大于14mm为灵敏，抑菌环直径小于或等于14mm为阴性，对此菌应再作胆汁溶菌实验，以证明是不是为肺炎链球菌。

　　（5）应用：

要紧用于肺炎链球菌（灵敏）与其它链球菌（耐药）的辨别。

（1）原理：

A群链球菌对杆菌肽几乎是100%灵敏，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。

故此实验可对链球菌进行辨别。

（2）培育基：

血琼脂平板。

　　（3）方式：

用棉拭子将待检菌的肉汤培育物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U的杆菌肽纸片，置35℃孵育18~24h，观看结果。