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生物蛋白纯化论文

Cementprotein的转化表达优化与纯化

摘要:

本实验将含有Cementprotein基因片段的重组载体pColdTF转化入E.coliBL21（DE3）中,在摇瓶培养的条件下，细胞中融合蛋白的含量达到60%以上；然后利用包涵体处理、复性、Ni-IDA亲和层析的方法纯化蛋白。

使用2.4L的菌液，经诱导、纯化、复性后大约可以得到10mg的蛋白；同时采用ELISA检测法，证实了纯化的SPG有很高的活性。

关键词：

融合蛋白的表达；Ni-IDA亲和层析。

Abstract:

Inthisstudy,containingCementproteinfragmentpColdTFrecombinantvectorwastransformedintoE.coliBL21（DE3）,inshakeflaskcultureconditions,cellproteincontentabove60%;Theninclusiontreatment,renaturation,Ni-IDAaffinitychromatographypurifiedprotein.Use2.4Lofbacteria,byinduction,purification,canberefoldedabout10mgofprotein;thesametimebyELISAassay,confirmedthepurificationoftheSPGhashighactivity.

Keywords:

proteinexpression;Ni-IDAaffinitychromatography.

目　　　　录

1引言………………………………………………………………1

2材料及方法…………………………………………………………1

2.1材料和试剂………………………………………………………1

2.1.1菌株与质粒………………………………………………………1

2.1.2主要试剂………………………………………………………1

2.1.3主要仪器………………………………………………………1

2.2方法与步骤………………………………………………………1

2.2.1重组质粒的转化…………………………………………………1

2.2.2转化子的筛选与鉴定…………………………………………1

2.2.3Cementprotein的纯化…………………………………1

2.2.4ELISA检测活性：

………………………………………………1

3结果与分析………………………………………………………2

3.1Cementprotein的诱导表达：

……………………………………2

3.2Cementprotein的分离纯化：

…………………………………3

3.3ELISA检测的结果：

……………………………………………3

3.4成品包装…………………………………………………………3

4结论…………………………………………………………………3

参考文献……………………………………………………………3

致谢……………………………………………………………………5

1引言［1］

亲和层析的原理是：

生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。

亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。

被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。

亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。

将制备的亲和层析剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时侯。

待分离的生物分子就与配体发生特异性结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。

通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。

亲和层析的优点是它分离蛋白经常只需要经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂生物蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。

它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定的蛋白纯化十分有利。

2材料

2.1材料和试剂

2.1.1菌株与质粒

大肠杆菌BL21（DE3）,Genscript保藏；表达载体pColdTF，Genscript保藏；pColdTF-Cementprotein，Genscript构建。

2.1.2主要试剂

Ni-IDA亲和层析凝胶：

Genscript生产；

LB液体培养基（g/L）：

胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeastextract）5g/L，氯化钠（NaCl）5g/L,用NaOH调节该培养基的pH为7.4；

氨卡青霉素溶液：

50µg/mL；

IPTG：

0.5mmol/L；

Tris-HCl：

50mM,PH8.0；

蛋白Marker:

TIANGEN公司,MP102；［2］

LysisBuffer:

50mMTris-HCl200mM；NaCl；pH8.0；

WashBuffer1:

50mMTris-HCl200mM；NaCl；20mM咪唑；pH8.0；

WashBuffer2:

50mMTris-HCl200mM；NaCl；50mM咪唑；pH8.0；

ElutionBuffer:

50mMTris-HCl200mM；NaCl；250mM咪唑；pH8.0；

洗涤缓冲液:

150mMPBS,0.5mLTween-20（0.13%）,PH7.4；

封闭液:

脱脂奶粉（5%）,PBS；

蛋白电泳试剂：

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、蛋白质分子量标准为上海生工公司产品；

丙烯酰胺储备液:

30%（w/v）丙烯酰胺，0.8%（w/v）甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加蒸馏水至100mL，用滤纸过滤后于棕色瓶中4℃存放；

分离胶缓冲液（1.5M/L，pH8.8）：

18.15gTris（分析纯），用1M/LHCl调节pH至8.8，加水至100mL，4℃存放；

浓缩胶缓冲液（0.5M/L，pH6.8）：

6gTris，用1M/LHCl调节pH至6.8，加水至100mL，4℃存放；

Tris-甘氨酸电泳缓冲液：

6gTris，28.8g甘氨酸，2gSDS，加水至2L；

SDS溶液（10%）：

10gSDS，加水定容至100mL，完全溶解后室温存放；

过硫酸铵溶液（10%）：

0.1g过硫酸铵（分析纯），加1mL蒸馏水溶解；

5×样品缓冲液：

0.6mLTris-HCl缓冲液（1mol/L，pH6.8）、5mL50%（v/v）甘油、2mL10%SDS、0.5mLβ－巯基乙醇、1mL1%（w/v）溴酚蓝、0.9mL蒸馏水。

4℃存放；

12%分离胶的配制：

蒸馏水3.5mL，30%丙烯酰胺储备液（A液）4mL，分离胶缓冲液（B液）2.5mL，10%过硫酸铵50µl，TEMED5µl；

5%浓缩胶的配制：

蒸馏水2.3mL，30%丙烯酰胺储备液（A液）0.67mL，浓缩胶缓冲液（C液）1.0mL，10%过硫酸铵30µl，TEMED5µl；

考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝R-2501g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，蒸馏水450mL；

脱色液：

甲醇200mL，冰醋酸200mL，蒸馏水1600mL。

封闭液：

5%脱脂牛奶或者20%BSA

2.1.3主要仪器

PK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）

TH2-25大容量恒温震荡器（上海欣蕊自动化设备有限公司）

JY98-3D超声细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）

GL21K高速离心机（湖南湘仪仪器有限公司）

HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）

IHZD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂）

TH-300梯度混合器（上海沪西分析仪器厂）

5414D型台式高速离心机（美国Eppendrof公司产品）

垂直板状电泳系统（Bio-Rad公司产品）

移液枪（DAIGGER）

水浴锅DK-8D（上海一恒仪器）

3方法与步骤

3.1Cementprotein重组质粒的转化［3］

1）取重组质粒；pColdTF-Cementprotein4µl于100µl感受态细胞BL21中，冰浴30min；

2）42℃水浴热激90s；

3）立即放置冰上冰浴3min；

4）加入600µl37℃预热的LB液体培养基，摇床震荡培养30min；

5）12000rpm离心2min，弃400µl培养基，剩约200µl，混匀菌体，涂布平板（A+）,37℃过夜培养；

3.2Cementprotein优化与表达鉴定［4］

1）取5支4mlLB试管培养基分别标记对照、1、2、3。

2）其中对照中加入50ul葡萄糖，对照、1、2、3，分别加入4ulA+，从平板中挑取5个白色菌落。

分别加入5支试管。

3）对照、1、2、37℃摇床培养,待OD=0.6时，加4ulIPTG，37℃，诱导培养4h；

4）4号试管37℃摇床培养,待OD=0.6时，加2ulIPTG，15℃，过夜诱导12h；

5）取4只EP管分别标记对照、1、2、3。

6）从试管中取200ul菌体，依次加入EP管中。

7）11000rpm,4min,4℃离心4min,去上清。

8）沉淀用15µlTris重悬；再加入15µl2×LoadingBuffer，沸水煮15min，离心，SDS-PAGED［5］电泳检测。

3.3Cementprotein可溶性分析

1）取4支1.5mlEP管标记1-沉淀、1-上清、3-沉淀、3-上清、取表达鉴定的1号管和3号管菌液分别加入1-沉淀、3-沉淀，5000rpm，3min，离心去上清，沉淀用200ulTris重悬。

2）超声破碎冰水浴［6］（间歇时间：

3s;工作时间：

3s；全程时间：

10min；）。

3）5000rpm，3min，离心，上清液分别倒入1-上清、3-上清中，1-沉淀、3-沉淀中沉淀用200ulTris重悬，4支EP管各加入200ul2×LoadingBuffer混匀沸水浴15分钟。

4）4支EP管各取8ul进行SDS-PAGE检测。

3.4Cementprotein扩大培养

1）接种，1%的接种量，接种到4mL液体LB培养基中，30℃,200rpm,摇床培养过夜，

即种子液；

2）转接，4mL的种子液转接到1LLB摇瓶,并向其中加入800µl的A+，37℃，180rpm摇床震荡培养4h；

3）诱导，1L培养基加入400µl的IPTG，于15℃摇床内，180rpm，过夜诱导12h；

4）收菌，7000rpm,7min,4℃离心收集菌体，收集的菌体放于-20℃备用。

3.5蛋白RAC-22的纯化［7］

3.5.1.超声破碎：

1）1L培养液菌体用30mLLysisBuffer重悬，将菌液置于冰水中，超声破碎（间歇时间：

3s;工作时间：

3s；全程时间：

15min；）；

3.5.2．菌体分离：

［8］

1）破碎液11000RPM离心15分钟。

取上清。

C.Ni柱纯化蛋白

1）装柱：

将层析柱洗净，用去离子水润洗柱子及管道，用适量的Ni-IDA介质（5ml）装入层析柱中；

2）平衡：

静置完成后，用LysisBuffer平衡介质至紫外检测仪示数稳定；

3）上样：

上清液以1ml/min的速度上样；

4）洗杂：

上样完成后，先用LysisBuffer洗涤；而后用WashBuffer1洗涤杂蛋白至紫外检测仪数值趋于稳定。

并收集样品。

标记“20”。

再用WashBuffer2洗涤至紫外检测仪数值趋于稳定。

并收集样品，标记“50”。

5）洗脱：

用ElutionBuffer洗脱目标蛋白，当紫外检测仪的示数开始变化后，取20ul加入350ul的G250中观察颜色变化。

当有G250由棕色变为蓝色时，开始收集流出液于无菌的塑料瓶中,洗脱直至样品不再使G250变蓝并紫外检测仪示数不再下降。

3.5.3透析［9］：

1）取2000ml透析液，将洗脱所得的溶液装入透析袋中，4℃，过夜透析12h，

3.5.4.蛋白复性:

将蛋白稀释至10mg/ml,100ul/ml的速度加入20倍体积的0.1M磷酸盐缓冲液.菌液于7000RPM,离心20分钟.取上清。

3.5.5.蛋白浓度和纯度的检测

1）蛋白浓度测定，取3mlG250,加入比色皿中。

A调100%，T调零。

取透析所得的蛋白溶液，50ul加入3MLG250中混匀，待分光光度计数值不再变化，记录数值。

2）电泳检测蛋白纯度，将蛋白电泳图片经专业软件测定蛋白纯度。

取样，取10µl电泳。

3.6．蛋白印记检测（Westernblot）［10］

3.6.1电泳

1）取样，取10µl，SDS-PAGE电泳。

3.6.2转膜

1）准备4-6张滤纸和1张PVDF膜或NC膜。

戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。

转膜前，NC膜要置于去离子水中浸泡1min；PVDF膜应在甲醇溶液中浸泡20min。

2）在转移液里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒或滴管、滤纸和浸过的膜。

3）取出SDS-PAGE胶将浓缩胶轻轻刮去。

将胶在转膜缓冲液中浸泡5分钟左右，以平衡离子强度。

4）打开平放底部黑色电极（阴极），放一张海绵垫片，擀气泡。

于海绵垫片上放置2-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，擀气泡。

取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上，排除所有气泡。

将PVDF膜或NC膜置于聚丙烯酰胺凝胶上，排除所有气泡。

在膜上盖上2-3张转移缓冲液浸泡过的滤纸，排除所有气泡。

最后盖上另一个海绵垫，放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板（白色），夹紧。

保证对凝胶有一定的压力。

5）将夹子放入转移槽中。

转膜在冰上进行，用磁力搅拌器搅拌。

用恒压60V或恒流200mA转移2h-2h30min。

3.6.3转膜免疫反应

1）取膜，将膜正面超上在PBST溶液中摇动五分钟，移至含有封闭液的平皿中，室温脱色摇床上4度静置过夜。

2）取出膜在PBST溶液中洗5分钟，放入含有一抗的PBST缓冲液中，室温下孵育1.5h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min；

3）膜放入含有二抗的PBST溶液中，室温下孵育1.5h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min；再用PBS洗二次，每次5min，进行化学发光反应。

3.6.4化学发光，显影，定影

1）将A和B两种试剂（Genscript公司HRP标记的底物）在离心管中上等体积混合，避光保存；用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的液体，正面朝上置与平整的保鲜膜上，加上以上的A、B混合液2ml，使膜正面与液体充分接触，避光静置3分钟；3min后，用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的液体，置与另一平整的保鲜膜上，包好，放入X-光片夹中。

2）在暗室中，将1×显影液和定影液各500ml分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小；把X－光片放在膜上，关上X-光片夹，曝光3分钟，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

立刻将X-光片浸入定影液中，定影10min，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

4．结果与分析

4.1．Cementprotein的表达鉴定［11］

挑取菌落至4mL培养基培养，标记对照、1、2、3，摇床培养当OD600≈0.6时加入4ulIPTG，而后对照、1、2、37℃诱导4小时，3号试管15℃过夜诱导12h，离心收集菌体,取样进行SDS-PAGE电泳分析。

Cementprotein表达鉴定检测图1.1

对照123M

．

如图所示，根据专业软件对蛋白基因序列分析此融合蛋白大小为58kd。

对照组没有58kd处无目的蛋白的表达，1号、2号为37℃、4h诱导有58kd处明显表达条带。

3号为15℃、过夜诱导58kd处也有明显表达条带。

4.2．Cementprotein的可溶性分析

取上述1号管3号管菌液400ul分别加入2支EP管中，离心去上清，沉淀用200ulTris重悬。

冰水浴超声破碎。

离心，上清液取样电泳，沉淀用200ulTris重悬，电泳。

Cementprotein可溶性分析检测图3.2

如图所示，破碎离心上清和沉淀中58kd处都有明显表达条带，因为蛋白在上清中活性较高，这意味着蛋白正确折叠率高，易与和柱体结合，纯化所得蛋白活性较高。

而15℃、过夜诱导蛋白分泌速率相对较慢，蛋白易正确折叠，所以优先采用15℃、过夜诱导。

这就是所谓的优先做上清。

4.3．Cementprotein的分离纯化

本实验采用Ni-IDA亲和层析一步纯化蛋白Cementprotein，最终得到的融合蛋白纯度能达到90%以上，

Cementprotein的分离纯化检测图

100kd

75kd

50kd

32kd

25kd

15kd

23Marker

如图所示Lane1为全菌破碎后蛋白条带58KD处有明显表达条带；Lane2为上清中蛋白条带58KD处有明显表达条带；lane3为上清过柱后流出条带；融合蛋白表达条带降低很多，说明融合蛋白大量挂柱；Lane4为20mm咪唑洗涤后流出有杂质和部分融合蛋白洗出；Lane5为50mm咪唑洗涤后流出有杂质和部分融合蛋白洗出；Lane6为250mm咪唑洗脱后流出融合蛋白被大量洗脱，且浓度和纯度很高。

4.4．Cementprotein的Westernblot检测

Cementprotein的Westernblot检测图

如图Westernblot检测58kd处有融合蛋白条带，证明纯化得到蛋白为实验预期纯化的融合蛋白。

5结论

5.1．本实验利用Ni离子与咪唑基特异的亲和性,使螯和有Ni离子的亲和层析柱可以用来纯化含有组氨酸的融合蛋白,在Cementprotein经过重组后,融合蛋白带上了HIS标签,在纯化时可以特异性结合在层析柱上,用含高咪唑的ElutionBuffer溶液使蛋白Cementprotein与杂蛋白分开由电泳的检测结果可知，用这种简单、快捷的一步纯化的方法,能够得到达到电泳纯的蛋白，而HIS标签并不影响蛋白Cementprotein的活性；

5.2．重组后的蛋白Cementprotein虽然很稳定，但在纯化的过程当中还要使蛋白溶液始终保持在低温冰浴的环境中。

接触到蛋白的容器一定要灭菌干净，避免杂菌的污染；

5.3．在用IPTG进行诱导表达时先做一个浓度梯度，实验发现终浓度在1mM,温度为37℃,时间为4h,融合蛋白产生量最多，但易形成包涵体。

终浓度为0.5mM,温度为15℃,时间为12h，上清中融合蛋白增多。

参考文献

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科学出版社，1999．40，41

致谢

本论文自始至终是在金思瑞（GenScript）生物科技（南京）有限公司蛋白部完成。

组长王成林（蛋白纯化工程师）、郭振宇（蛋白纯化工程师）、蔡立涛（蛋白纯化工程师），技术员张正卫、崔明（蛋白纯化工程师），给了我很大的。

在这期间我的老师和同学，也给了我极大的帮助。

让我论文如期完成。

在这里我向以上各位表示最真挚的感谢。

同时我也感谢父母养育了我，学校培育了我。