血液检测方法的确认.docx
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血液检测方法的确认
血液检测方法的确认
B.1总则
本附录讨论了血站血液检测实验室采用一项新的检测方法，或更换现有检测方法时需要考虑的因素。
通常血液检测方法包括完成检测必需的仪器、试剂、校准品、实验程序组合。
检测方法必须由实验室选择。
必须按照生产商的说明书进行操作，确保检测结果符合实验室的要求。
血站对献血者及其捐献的血液进行强制性血液筛查，包括输血相关感染病原学标志物检测、血型血清学检测和酶学检测。
方法学包括ELISA法、凝集法、速率法等，以及用于献血者采血前检查的快速诊断实验。
由于以上方法学原理的不同，方法确认的原则也不同。
依据当今国际公认的一些法规和指南，本附录提供了血站血液检测实验室常规使用的检测方法确认的原则和步骤，诣在提高血液检测实验室对检测方法确认的一致性和效率，确保检测方法变化的过程得到有效控制。
帮助用户满足文件和法规的要求。
B.2范围
为血站血液检测实验室检测方法确认提供方案。
实验室需选择国家批准的符合国家要求的仪器、试剂盒或检测方法。
在新方法投入常规使用报告检测结果之前，需要就检测方法在实验室的使用性能进行确认。
不建议实验室对生产商提供的检测方法进行自行改动，如果确实需要修改，应与生产商合作进行新检测方法性能的评价测试，以确认修改后的系统在实验室的适用性和可靠性。
需确认的对象包括：
实验室首次引入的检测方法，如实验室从未使用过的试剂、仪器等。
实验室首次将某项目引入现用检测方法，如HBsAg项目由A仪器检测改为由B仪器检测。
若多台仪器（相同品牌和型号）检测同一个项目，应对每一台仪器的性能进行确认比较。
B.3输血相关感染标志物检测方法的确认
以下内容适用于酶联免疫吸附试验的确认。
快速诊断试验和确证试验等定性方法的确认可参照本章节内容。
B.3.1确认的一般要求
B.3.1.1实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。
生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。
生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作。
B.3.1.2试剂的准备
应选择经国家检定合格的病原学标志物诊断试剂。
严格遵从生产商的说明书进行操作。
对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代或实验室自己配制。
B.3.1.3仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。
实验开始前，按要求对仪器进行维护校准。
对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。
如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
B.3.1.4质量控制
应建立有效的质量控制程序。
除直接采用生产商提供的质控品外，还应选择质量、来源稳定，无基质效应的质控品作为另外的室内质控物。
如可能，多实验方法比较过程中，应采用相同质控物。
一些定性实验每天只需要使用阴性和阳性质控物，而另一些定性实验可以产生量化的质控结果。
对此可以采用统计过程控制方法（SPC），用量化数据监控实验过程。
确认实验采用的标本不能等同于质控品使用。
实验过程中，应确保过程处于受控状态，否则必须重新实验。
B.3.1.5保持记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。
保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
B.3.2重复性实验
生产商提供的阴性阳性对照实验
B.3.2.1.1实验程序：
采用生产商提供的阴性、阳性对照，在不低于10天实验运行的前提下，进行至少20次检测。
B.3.2.1.2可接受标准：
20次检测结果不能出现大于1次阴性阳性对照不符合生产商要求。
否则实验室必须终止实验，咨询试剂生产商，查找原因，采取纠正措施。
B.3.2.2方法精密性实验
B.3.2.2.1实验程序：
在定性实验中，如果能够产生量化实验结果（如ELISA实验），应采用接近临界值的标本，对精密度进行估计。
建议采用S/CO为2～4的标本，不适宜采用低值的阴性标本和高值阳性标本，因为此类标本距决定水平点即临界值（cutoff）的分析浓度相距较远。
B.3.2.2.2可接受标准：
批内变异系数在15%以内，批间变异系数在20%以内。
B.3.3灵敏度及特异性实验
本实验采用已知真实血清学状态的标本，经检测获得方法灵敏度和特异性方面的信息。
也可以将不同方法的灵敏性和特异性进行比较，得到量化的差异结果，判断是否具有统计学意义。
B.3.3.1标本的选择
灵敏度和特异性实验通常对已知真实血清学状态的标本进行检测。
确定标本真实血清学状态可以采用金标准方法或临床诊断方法。
参考血清盘或能力验证（PT）的标本可用于本实验。
参考血清盘是指经过检测或经过与公认方法比较，或具有临床诊断意义的标本。
这些标本已经确立了真实的血清学状态，可追溯至经典方法或临床诊断结果。
可以从权威机构、专业研究机构和文献中获得参考血清盘的来源。
参考血清盘应包含具有不同分析物浓度的临床标本。
如可能，血清盘应包含对检测具有干扰的标本。
如可造成假阴性和假阳性结果的自身免疫性疾病、螺旋体疾病、白细胞抗体、风湿性关节炎、多发性骨髓瘤患者的标本。
尽管商品化参考血清盘在方法确认过程中，具有很好的时间和资源效率，但其局限性在于可能忽视了实验室目的检测人群中疾病的流行率和病原学因子抗原谱的分布。
因此，使用参考血清盘、能力验证标本结合常规实验室检测标本，可以提供更有意义、更可靠的确认结果。
PT材料可能存在基质干扰，对方法性能产生错误判断。
当PT材料为临界标本，或分子结构不同于天然血清，导致抗原决定簇不能被正常识别时，这种干扰尤其明显。
B.3.3.2标本的数量
标本数量的估算，统计学中称为标本含量的估算依据实验设计的类型、结果变量的性质、研究目的和采用的统计分析方法而不同。
对于检测结果为计数资料的实验（如定性实验），一般而言，在实验误差控制较好的情况下，不同血清学状态的标本数量至少为30份。
否则可能影响实验的统计学功效。
B.3.3.3标本的保存
应确保标本可用于常规检测并处于稳定状态，尽可能保持实验标本新鲜。
如需冻存，血清或血浆应保存在-20℃的条件下。
实验标本的保存状态、冻融次数、使用次数和时间应尽量一致，避免标本产生偏差。
如需要方法比较实验，应在相同时间进行，最大限度减小由于标本放置时间不同产生的结果差异。
B.3.3.4数据的收集和整理
及时记录和检查所有实验数据，尽早发现系统和人为的误差。
如果能够确定一些结果是由于可知的差错造成，应详细记录差错原因，数据不能用于后续分析过程。
如果不能够确定产生异常结果的原因，在数据组中保留原始结果。
B.3.3.5数据的分析
B.3.3.5.1单一检测方法灵敏性和特异性估计
如果明确了每份检测标本真实的血清学状态，检测方法的灵敏度和特异性很容易计算。
表Ｂ－1为反映一个定性实验检测已知真实血清学状态标本的结果的2×2四格表资料。
通过这组数据可以计算被估计的灵敏度、特异性。
表B－1试验方法结果与诊断结果的2×2四格表
诊断结果
方法结果
阳性
阴性
总计
阳性
A
B
A+B
阴性
C
D
C+D
总计
A+C
B+D
N
B.3.3.5.1.1灵敏度和特异性
估计灵敏度＝100%〔A/（A+C）〕
估计特异性＝100%〔D/（B+D）〕
灵敏度和特异性95%置信区间可通过二项分布计算。
B.3.3.5.2两方法灵敏度和特异性的比较
可采用完全随机设计和配对设计实验，比较两检测方法的灵敏度和特异性。
完全随机设计时，可采用完全随机设计x2检验。
两方法采用不同的标本，标本相对独立。
这种情况下两方法灵敏度和特异性的比较实际是两样本率的比较。
配对设计时，可采用配对设计的McNemarx2检验。
两方法采用相同的标本，得到两个相关的灵敏度和特异性，这时注意当标本数较少时，需要计算校正x2或采用精确概率法检验。
详细计算见B.3.3.5.3。
注意如果需要判断检测方法的准确性，单凭比较灵敏度和特异性是不够的。
除非一个方法的灵敏度和特异性均大于或小于另一方法，否则只能比较相同灵敏度时的特异性，或相同特异性时的灵敏度。
当灵敏性和特异性均不相同时，很难比较两方法准确性。
这时可采用受试者工作特征曲线法（ROC曲线法）进行比较。
该法是近年来公认的评价和比较检测方法准确度的较好方式。
该方法可以考虑检测方法在所有临界值时的灵敏度和特异性。
通过比较不同方法ROC曲线下的面积，确定和参考方法的特性。
鉴于此项内容不在本规程要求的范围，实验室人员如需要了解更多信息，可以查找相关资料。
如果需要量化两方法灵敏度和特异性之间差异，可以对灵敏度或特异性的差异进行估计。
以配对设计实验为例，两方法采用相同的标本进行检测的结果可以汇集成表B－2。
如果两方法采用的标本不同，则不能采用表2的方式整理数据。
表B－2两方法结果和诊断结果的三项比较
方法结果
总标本数
真实诊断结果
方法1
方法2
阳性
阴性
阳性
阳性
a=a1+a2
a1
a2
阳性
阴性
b=b1+b2
b1
b2
阴性
阳性
c=c1+c2
c1
c2
阴性
阴性
d=d1+d2
d1
d2
总标本数
N
n1
n2
B.3.3.5.2.1两方法灵敏度差异估计
两方法灵敏度估计
灵敏度1=100%[（a1+b1）/n1]
灵敏度2=100%[（a1+c1）/n1]
两方法灵敏度差异估计
灵敏度1－灵敏度2=100%[（b1－b1）/n1]
B.3.3.5.2.2两方法特异性差异估计
两方法特异性估计
特异性1=100%[（c2+d2）/n2]
特异性2=100%[（b2+d2）/n2]
两方法特异性差异估计
特异性1－特异性2=100%[（c2－b2）/n2]
B.3.3.5.3不同检测方法检测结果的统计分析
通常采用配对设计四格表x2检验和Kappa检验评价两个定性检测方法性能的差异或一致性。
如果已知标本的血清学状态，或者已存在特设或隐含的金标准结果，可采用配对设计四格表x2检验中的McNemarx2检验评价两方法结果的不一致性，Kappa检验评价两方法结果的一致性。
如果未知标本的血清学状态，检测结果有序变量的档次划分也是相同的，也可以采用Kappa检验评价两种检测方法结果的一致性。
另外，两方法的符合性指标也能够量化两种检测方法结果的一致程度。
B.3.3.5.3.1配对设计四格表x2检验（McNemarx2检验）：
对于隐含金标准或特设金标准的2×2四格表资料，可采用McNemarx2检验，判断两种检测方法结果不一致部分是否具有统计学意义。
该法适用于标本含量适中的资料，因为本法仅仅考虑两检测方法不一致的情况，而未考虑两方法检测结果一致的情况。
当n很大，两方法一致率较高，不一致结果数量较小，即使McNemarx2检验具有统计学意义，但实际意义往往不大。
通常适用于b+c≥40。
注意当25≤b＋c＜40，采用McNemar检验分析配对设计四格表资料需作连续性校正。
若b+c＜25，应采用精确概率法检验。
B.3.3.5.3.2Kappa检验：
Kappa统计量是Cohen1960年提出的一种校正机遇之后衡量两种检测方法一致性的指标。
Kappa（常缩写成K）值在－1到＋1之间，如果K＝－1，说明两种检测方法检测的结果完全不一致；K＝0，说明观察的一致性完全由偶然误差造成；K＝1，说明完全排除机遇一致性后的真正一致性。
一般对总体而言，若K＞0.75，表明一致性为优；若K在0.4～0.75之间，表明一致性良好；若K＜0.4，表明一致性较差。
B.3.3.5.3.3两种检测方法结果的符合性估计
如果需要量化两方法检测结果的符合程度，可以对两方法检测结果的符合性进行估计。
方法2
方法1
阳性
阴性
总计
阳性
a
b
a+b
阴性
c
d
c+d
总计
a+c
b+d
B.3.3.5.3.4符合性＝100%[（a+d）/n]
B.4ALT检测方法的确认
以下内容适用于ALT速率法确认。
其它定量检测方法确认可参照本规程。
B.4.1确认的一般要求
B.4.1.1实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。
生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。
生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作被确认系统。
B.4.1.2试剂的准备
应选择国家批准生产的ALT诊断试剂。
严格遵从生产商的说明书进行操作。
对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代或实验室自己配制。
B.4.1.3仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。
实验开始前，按照要求对仪器进行校准。
校准品必须能够溯源至国家或国际标准。
可以由校准品的生产商提供相关的校准程序和溯源证明。
对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。
如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
B.4.1.4质量控制
应建立有效的质量控制程序。
选择质量、来源稳定，无基质效应的质控品作为室内质控物。
确认实验采用的标本不能等同于质控品使用。
应确保实验过程处于受控状态，否则必须重新实验。
B.4.1.5保持实验记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。
保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
B.4.2正确度的估计
正确度估计最常用的方法：
方法比较实验：
采用新的检测方法和参加过能力验证的检测方法或公认的参考方法，同时检测一批不同ALT浓度的标本。
通过结果的差异了解新系统引入后的偏倚是否在允许误差范围内。
通常将新系统方法称为比较方法（y），与之比较的系统方法称为参考方法（x），该实验也称为方法学比较实验。
能力验证活动：
直接参加权威机构组织的能力验证活动，能力验证的成绩可以证明新的检测方法检测结果的准确性。
以下为方法比较实验的设计和数据分析过程。
B.4.2.1标本的选择
B.4.2.1.1标本数量：
实验标本数至少40份，更多的标本量可以使实验结果更加可靠。
每份标本应有足以完成双份测定的量。
如果不够，可以将分析物浓度接近的两份标本混合使用。
B.4.2.1.2标本分析物浓度范围：
如可能，应选择有50％实验标本的分析物浓度不在参考范围内。
B.4.2.2实验程序
时间至少5天。
采用两种方法，将标本按照序号递增和递减的顺序测定2次。
如第1次检测序号为1、2、3、4、5、6、7、8，第2次为8、7、6、5、4、3、2、1。
当天的方法比较实验应在2小时内完成。
B.4.2.3数据分析
B.4.2.3.1初步判断：
剔除有明显人为误差的结果。
内部质控失控时，必须重新检测。
B.4.2.3.2离群点的剔除：
设参考方法测定结果为x值，第一次测定值为x1，第二次测定值为x2。
比较方法测定结果为y值，第一次测定值为y1，第二次测定值为y2。
B.4.2.3.3方法内重复测定值离群点的去除
计算△xi=∣xi1-xi2∣；△yi=∣yi1-yi2∣
计算
；
计算4
，4
以4
和4
为离群限值，如果没有超出，继续方法间配对结果离群点检验；否则继续相对差异检验，进行如下最终判断
计算
；
计算
；
最终以4
和4
为判断离群点限值
B.4.2.3.4方法间配对结果离群点的去除
计算Eij＝∣yij-xij∣，i为标本序号1～40，j为重复结果序号1或2。
计算
以4
为离群限值。
如果全部实验数据中离群点超过2个，应补充实验数据。
B.4.2.3.5初步判断线性回归状况
x－y散点图
以参考方法所有结果为x值，比较方法所有结果为y值，绘制散点图。
以参考方法每个标本两次检测结果的均值为x值，比较方法每个标本两次检测结果的均值为y值，绘制散点图。
比较两图有无明显差异。
如无明显差异，说明方法比较实验的随机误差对比较结果影响不大。
x均值（x－y）均值差散点图
以参考方法每个标本两次检测的均值为x值，两方法实验结果均值差（x－y）为y值，绘制散点图。
观察均值差随x值增大的变化。
如果点的分布表现出一定的趋势，预示着两方法之间系统误差的存在。
B.4.2.3.6标本分析物浓度分布检验
实验点的离散度和对应分析物浓度分布的宽度都会影响r值的大小。
一般如果r≥0.975（r2≥0.95），x取值范围适宜，否则应扩大数据范围。
B.4.2.3.7线性回归计算
每份标本用两个方法进行两次测定。
将参考方法的x1和比较方法的y1对应，参考方法的x2和比较方法的y2对应，组成成对数据。
采用所有成对数据进行直线回归。
得回归方程
。
理想状态下
，即b＝1，
＝0。
如果b≠1，
≠0，说明两方法间存在系统误差，需要对误差进行评估。
如了解Y方法引入后相对于X方法在临床决定水平浓度Xc处的系统误差（SE）。
B.4.2.4可接受标准
r≥0.975或r2≥0.95。
医学决定水平处新方法引入的系统误差小于CLIA’88允许误差的1/2。
B.4.3精密度的估计
精密度估计最常用的方法是采用稳定的标本进行重复检测。
求得均值（x）、标准差（s）和变异系数（CV）。
精密度的好坏通常采用不精密度表示，不精密度通常以CV体现。
应在明确标本的来源、浓度、实验周期的前提下，确定检测方法的不精密度。
B.4.3.1标本的选择
B.4.3.1.1标本分析物浓度范围：
鉴于血站血液检测实验室检测对象为健康的献血人群，可采用中、低两个ALT浓度的标本进行精密度实验。
标本的基质应近似于人源标本。
B.4.3.1.2标本的保存：
精密度实验需要在若干天内完成，对于冰冻保存的标本和冻干复溶标本，应严格控制操作手法均一、复溶时间、加液的准确性、混匀的力度等，力求实验标本的稳定、均一。
B.4.3.2实验程序
B.4.3.2.1对每个水平的标本分别做批内和天间的重复测定。
精密度实验与常规标本检测同时进行，不可替代实验的质量控制过程。
B.4.3.2.2批内实验：
将实验标本插入常规检测标本一同检测。
一批内连做20次。
对应质控结果为受控状态。
B.4.3.2.3批间实验：
每天对实验标本做1次检测，连做20天。
每天对应质控结果为受控状态。
B.4.3.3数据分析
B.4.3.3.1标准差计算
批内和天间标准差均可采用以下公式计算
B.4.3.3.2变异系数计算
批内和天间变异系数均可采用以下公式计算
×100
B.4.3.4可接受标准
参照Westgard和Ceroblewski等提出高效检验对精密度要求的观点，批内不精密度CV应小于CLIA允许误差的1/4，批间不精密度CV应小于CLIA允许误差的1/3。
对于ALT实验，CLIA允许误差限值T±20%，因此ALT检测方法的批内不精密度CV应小于5%，批间不精密度CV应小于6.7%。
B.4.4检测可报告范围
检测可报告范围确认实验通常采用配制包含不同分析物浓度的系列标本进行检测，将按稀释比例计算的预期值和实际测量值设置为两个变量进行线性回归。
回归直线应当为过原点，斜率为1的直线。
直线所达的限值即为结果的检测范围。
B.4.4.1标本的选择
准备一份ALT<30IU的低浓度血清（L）和ALT在500IU左右的高浓度血清（H）。
将高低两份血清按照5L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，5H的比例配制混合，形成系列血清。
B.4.4.2实验程序
检测系列血清，每份标本重复4次。
B.4.4.3数据分析
B.4.4.3.1剔除异常点：
剔除明显异常的检测结果，并补充数据。
B.4.4.3.2计算预期值：
计算低值和高值标本的结果均值。
按照稀释关系，计算每个标本的分析物理论浓度，即为预期值。
B.4.4.3.3预期值－实测值的线性回归：
每个标本有4个重复实验的实测值。
每个实测值与其预期值相对应，形成成对数据。
以x表示预期值，y表示实测值，描点绘图。
得到回归方程
。
B.4.4.3.4初步判断：
理想状态下
中b＝1，
＝0。
但实际工作中很难达到。
因此如果b在1.00±0.03的范围内，
近于0，则可直接判断该方法可报告范围在实验涉及浓度范围内。
B.4.4.3.5如果b不接近1，
较大，应具体分析高浓度还是低浓度的预期值和实测值存在较大偏倚。
可以舍去某组数据，重新进行回归计算。
如果缩小范围后，b和
能够满足要求，即说明缩小的浓度范围即是实际的检测范围。
B.4.4.3.6可以通过以下统计假设检验进行判断。
B.4.4.3.6.1截距a和0差异的t检验
假设H0：
a=0；H1：
a≠0；
计算
计算
计算
，
B.4.4.3.6.2斜率b和1差异的t检验
假设H0：
b=1；H1：
b≠1；
计算
计算
计算
，
B.4.5正常值参考范围确认
采用新方法对20份健康献血者血液标本进行检测。
最多允许1个结果不在试剂盒提供的参考范围内。
B.5ABO血型和RhD抗原检测方法的确认
以下内容适用于献血者血型血清学方法确认。
B.5.1确认的一般要求
B.5.1.1实验操作的培训
开始确认新的检测方法之前，操作人员应当有充分的时间熟悉新系统，确定关键的操作步骤。
生产商应提供试剂或仪器的操作说明，实验原理，规格，实验步骤，局限性，质量控制和健康安全信息。
生产商应对操作者进行培训，确保操作人员正确操作。
B.5.1.2试剂的准备
应选择国家批准使用的血型试剂，严格遵从生产商的说明书进行操作。
对于正在进行确认的试剂，所有组份应来源于同一批试剂，不能由其他试剂所替代（即使另一种试剂为同一厂家生产）或实验室自己配制。
实验室对试剂自行修改，如稀释试剂，应取得生产商的认可，因为任何修改可以导致对试剂的质量保证失效，并产生相关责任。
B.5.1.3仪器的准备
应选择国家批准使用的检测仪器。
实验开始前，按照要求对仪器进行维护校准。
对于开放试剂的仪器设备，特别注意试剂说明书要求的操作条件与仪器性能是否相适应。
如果仪器性能与试剂盒说明书的要求有差异，可以征得试剂生产商协助和同意，对本实验室仪器的实验操作参数进行修正，以达到试剂盒要求的实验状态。
B.5.1.4质量控制
应建立有效的质量控制程序。
确保常规平行实验中已知抗原和已知抗体的质控物反应正确，否则必须重新实验。
B.5.1.5保持实验记录
应记录和监控操作人员在实验过程中的健康安全，确保符合法律要求。
保留检测全过程的数据和结果，包括检测的速度和使用的适宜性等。
B.5.2平行确认实验
所有实验室应采用平行实验的方式，用常规标本，将新方法与现用方法进行比较，确认新方法的常规使用状态。
实验时间最短1周。
操作程序和实验结果应文件化。
应定期进行关键标本（弱抗原或弱抗体标本）重复实验，确认方法的稳定性和耐用性。
B.6确认记录
B.6.1实验过程记录应包括：
B.6.1.1检测标本类型及各类型数量；
B.6.1.2检测日期；
B.6.1.3操作实验者的级别和能力；
B.6.1.4使用试剂的详细资料，包括：
批号、效期等；
B.6.1.5采用修正条件的详细资料，如温度、孵育时间，离心力、加速减速率、离心时间；
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