高考生物二轮复习讲义第40讲 无菌操作技术实践.docx

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高考生物二轮复习讲义第40讲无菌操作技术实践

1．涵盖范围

本单元包括选修1全部内容——无菌操作技术实践、发酵技术实践、酶的应用技术实践和生物化学与分子生物学技术实践。

2．考情分析

考查力度：

相对固定，如山东理综只出一个8分的简答题。

考查内容及形式：

（1）微生物的培养与应用多以简答题形式考查。

（2）酶的研究与应用，常与必修1中酶的本质、特性等知识有机结合考查。

（3）植物的组织培养技术常与植物有效成分提取相结合考查。

（4）传统发酵技术及实践应用多以简答题形式考查。

（5）酶的研究、DNA和蛋白质提取技术多以选择题形式考查。

3．复习指导

（1）复习线索

①以转基因——微生物培养——酶生产——酶应用为线索，系统复习微生物培养技术、酶的研究和实践应用。

②以技术手段、技术流程为主线，复习发酵、组织培养、有效成分及DNA、蛋白质提取等有关知识。

（2）复习方法：

①列表比较法——DNA、蛋白质的提取与分离。

②实践联系——发酵技术、植物有效成分提取技术。

③实验联系——植物组织培养、微生物培养实验过程。

第40讲　无菌操作技术实践

[考纲要求]　1.微生物的分离和培养。

2.某种微生物数量的测定。

3.培养基对微生物的选择利用。

4.植物的组织培养。

考点一　微生物培养基的配制、无菌操作和接种技术

1．培养基的判断

（1）据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型（　×　）

（2）培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分（　√　）

（3）在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求

（　√　）

2．制备固体培养基的流程

→

→

→

→

3．无菌技术连接（连一连）

4．纯化大肠杆菌的方法

常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。

（1）平板划线法：

是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

（2）稀释涂布平板法：

是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面。

5．微生物的接种过程

准备接种→接种环灭菌→试管灭菌→挑取少量菌体→划线接种→培养

易错警示　

（1）自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同

①自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。

②含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。

（2）配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项

①倒平板的适宜温度是50℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。

②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

（3）平板划线操作的注意事项

①第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。

②灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

③划线时最后一区不要与第一区相连。

④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。

1．下列无菌操作中，错误的是（　　）

A．无菌操作的目的是防止杂菌污染

B．用酒精擦拭双手的方法对操作者进行消毒

C．实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行

D．玻璃器皿（吸管、培养皿）可用酒精擦拭

答案　D

解析　对操作者应用较温和的方法进行消毒。

实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行，防止瓶口的微生物污染培养基。

对无菌操作用到的玻璃器皿要用干热灭菌的方法彻底消灭其中的微生物，用酒精擦拭不能达到目的。

2．下列是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。

请回答：

试剂

牛肉膏

蛋白胨

NaCl

琼脂

水

用量

5g

10g

5g

20g

1000mL

（1）培养基的类型有很多，但培养基中一般都含有水、碳源、____________和无机盐。

上述培养基配方中能充当碳源的成分是__________________________。

培养基配制完成以后，一般还要调节pH，并对培养基进行__________处理。

该培养基从物理性质上分类属于____________。

（2）分离纯化微生物最常使用的接种方法是____________和____________________。

（3）假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？

（列举两项）

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

答案　

（1）氮源　牛肉膏和蛋白胨　灭菌　固体培养基　

（2）平板划线法　稀释涂布平板法　（3）稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌即接着划第二次；培养过程中灭菌不严格，受到了其他微生物的污染（任选两个）

解析　培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。

配制培养基时加入了琼脂，因此该培养基属于固体培养基。

培养基配制完成后要调pH和灭菌。

牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。

分离纯化微生物一般用平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法中每次划线前都要将接种环灼烧灭菌，以杀死上次划线时接种环上残留的菌种；采用稀释涂布平板法时稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。

1．培养基的营养构成

（1）各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。

（2）不同培养基要满足不同微生物对pH、特殊营养物质及氧气的需求。

2．培养基的种类

划分标准

培养基种类

特点

用途

物理

性质

液体培养基

不加凝固剂

工业生产

半固体培养基

加凝固剂，如琼脂

观察微生物的运动、分类、鉴定

固体培养基

微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

化学

成分

天然培养基

含化学成分不明确的天然物质

工业生产

合成培养基

培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）

分类、鉴定

半合成培养基

培养基成分有已明确的，也有天然成分

功能

基础培养基

含有野生型微生物所需的所有营养物质

用于野生型微生物培养

选择培养基

缺乏相应的营养成分

选择微生物

鉴别培养基

加入显色剂的培养基

用于微生物鉴定

3.消毒和灭菌比较

比较项目

理化因素的作用强度

消灭微生物的数量

芽孢和孢子能否被消灭

消毒

较为温和

部分生活状

态的微生物

不能

灭菌

强烈

全部微生物

能

4.两种纯化细菌的方法的比较

项目

优点

缺点

平板划线法

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

不能计数

稀释涂布平板法

可以计数，可以观察菌落特征

吸收量较小，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延

考点二　微生物的分离、培养和数量的测定

1．分解尿素的细菌的分离与计数

（1）完善土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

①分离原理：

土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

②培养基类型：

选择培养基。

③统计菌落数目：

统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

④实验流程：

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

⑤鉴定分解尿素的细菌

a．原理：

CO（NH2）2＋H2O

CO2＋2NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。

b．方法：

以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。

（2）判断正误

①只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（　√　）

②筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的惟一氮源（　√　）

③统计样品中的活菌一般用平板划线法（　×　）

④在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌（　×　）

2．分离土壤中能分解纤维素的微生物

（1）培养基：

以纤维素为惟一碳源的选择培养基。

（2）筛选流程

土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。

易错警示　

（1）在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。

（2）统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

这是因为当两个或多个细胞连在一起时，

平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

3．自然界中的微生物往往是混杂生长的。

人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。

下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

实验步骤：

（1）制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

（2）为了得到更加准确的结果，你选用____________法接种样品。

（3）适宜温度下培养。

结果分析：

（1）测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是____________，其理由是_________________________________________

________________________________________________________________________。

A．一个平板，统计的菌落数是230

B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240

C．三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260

D．四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250

（2）一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是__________（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）。

（3）用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测得的数量____________，因为________________________________________________________________________

______________________。

答案　实验步骤：

（2）稀释涂布平板

结果分析：

（1）D　在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否合理　

（2）2.34×108　（3）多　当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

解析　实验步骤：

为了得到更加准确的结果，应用稀释涂布平板法接种样品。

结果分析：

（1）选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。

（2）234÷0.1×105＝2.34×108。

（3）因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

4．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（　　）

A．以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B．以尿素为惟一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C．以尿素为惟一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

D．以尿素为惟一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

答案　A

解析　在以尿素为惟一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。

若培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红。

此培养基既属于选择培养基，又属于鉴别培养基。

1．分离微生物的方法

从混合样品中获得某种微生物的方法通常有两种：

（1）利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。

（2）利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。

2．选择培养基与鉴别培养基的比较

种类

制备方法

原理

用途

举例

选择培养基

培养基中加入某些化学物质

依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计

从众多微生物中分离所需的微生物

加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

鉴别培养基

培养基中加入某种指示剂或化学药品

依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计

鉴别不同种类的微生物

伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌

3.选择培养基及应用实例

（1）选择培养基：

在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的生物。

（2）选择培养基应用实例

①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分

离效果。

如石油是惟一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

⑤改变微生物的培养条件，可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。

4．统计菌落数目的方法

（1）显微镜直接计数法

①原理：

利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。

②方法：

用计数板计算。

③缺点：

不能区分死菌与活菌。

（2）间接计数法（活菌计数法）

①原理：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②操作：

a.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

③计算公式：

每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。

5．对照原则的运用

（1）判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。

（2）判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。

考点三　植物的组织培养

1．原理：

植物细胞的全能性。

2．基本过程：

外殖体

愈伤组织

试管苗

植株

3．应用实例

（2）月季的花药培养过程

①过程：

材料的选取→材料的消毒→接种和培养→鉴定和筛选。

②影响花药培养的因素主要有材料的选择和培养基的组成。

4．影响植物组织培养的因素（判一判）

（1）植物激素的浓度可影响细胞分化，但使用的先后顺序及比例不影响组织培养的过程

（　×　）

（2）pH、温度和光照等也影响植物组织培养（　√　）

易错警示　实验操作中易错的几个问题

（1）材料的选取：

天竺葵的组织培养实验中，应选择嫩幼的叶；月季的花药培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。

（2）外殖体消毒：

所用消毒剂为体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。

5．植物组织培养可用于无病毒植株及细胞产物的工厂化生产等方面。

请回答相关问题：

（1）若要进行兰花无病毒植株的培育，首先选择兰花的________________作为外殖体。

从外殖体到无病毒植株试管苗，要人为控制细胞的________________和________________

过程。

（2）进行组织培养需配制MS培养基，在该培养基中常需要添加____________、____________等植物激素。

欲有利于根的分化，植物激素的用量比例应为____________。

（3）不同植物的组织培养除需营养和激素外，____________________________等外界条件也很重要。

（4）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，下列各项中使用化学药剂进行消毒的是____________，采用灼烧方法进行灭菌的是____________。

（填序号）

①培养皿　②培养基　③实验操作的双手　④三角锥形瓶⑤接种环　⑥花蕾

答案　

（1）茎尖分生组织　脱分化（或去分化）　再分化　

（2）生长素　细胞分裂素（两空顺序可以颠倒）　生长素多于细胞分裂素　（3）pH、温度和光照　（4）③⑥　⑤

解析　

（1）根尖、茎尖约0～0.1mm区域中几乎不含病毒。

病毒通过维管系统移动，而分生组织中不存在维管系统，且茎尖分生组织中，代谢活力高，竞争中病毒复制处于劣势。

（2）生长素与细胞分裂素等植物激素可调节脱分化和再分化。

当生长素含量多于细胞分裂素含量时，利于生根。

（3）植物培养时，除需要营养、激素外，还需要适宜的温度、pH和光照等。

（4）对实验器具进行灭菌处理，对实验过程中的具有生物活性的材料或用具进行消毒处理。

1．植物组织培养技术和花药离体培养技术的异同

项目

内容　　

天竺葵的组织培养

月季的花药培养

理论依据

植物细胞的全能性

基本过程

脱分化→再分化

外殖体的细胞类型

体细胞

生殖细胞

操作流程

制备培养基→外殖体消毒→接种→培养→移栽→栽培

选材→消毒→接种和培养→筛选和诱导→移栽→栽培选育

影响因素

选材、营养、植物激素、pH、温度、阳光等

培养结果

正常植株

单倍体植株

生殖方式

无性生殖

有性生殖

可育性

可育

高度不育，秋水仙素处理后可育

2.植物激素与组织培养

（1）生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点：

①在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。

②使用顺序不同，结果不同，具体如下：

使用顺序

实验结果

先使用生长素，后使用细胞分裂素

有利于细胞分裂，但细胞不分化

先使用细胞分裂素，后使用生长素

细胞既分裂也分化

同时使用

分化频率提高

③用量比例不同，结果也不同

3．影响植物组织培养的因素

（1）材料：

植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。

一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。

嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

（2）营养：

常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。

（3）环境条件：

pH、温度、光照等条件。

如天竺葵的组织培养所需pH为5.6～5.8左右，温度为15～20℃，光照强度为1000～2000lx条件下灯照射10h。

1．（2012·北京卷，5）高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是（　　）

A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中

B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上

C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上

D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

答案　C

解析　在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外殖体的生长，甚至杀死外殖体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果影响也不会太大。

2．（2009·安徽卷，6）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是

（　　）

A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

答案　D

解析　采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

3．（2011·新课标全国卷，39）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。

某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。

回答问题：

（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为惟一碳源的固体培养基上。

从功能上讲，该培养基属于________培养基。

（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即____________和

____________。

（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。

（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和____________。

无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。

答案　

（1）原油　选择　

（2）平板划线法　稀释涂布平板法（3）强　（4）干热灭菌　高压蒸汽灭菌　火焰

解析　

（1）可以将所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。

欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，能降解原油的细菌才能在只含原油这一碳源的培养基上生存。

（2）分离纯化菌种时，接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。

（3）降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。

（4）实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌（如接种环）、干热灭菌（如培养皿）和高压蒸汽灭菌（如培养基）等。

无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。

4．（2009·宁夏卷，40）

（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑________、____________和渗透压等条件。

由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、____________、________________等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。

（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和________；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_______________________________________。

（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的______________。

（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________________。

（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培