国家自然基金申请成功范本1doc.docx

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二、立论依据

（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处。

）

对基础研究,着重结合国际科学发展趋势,论述项目的科学意义；

对应用基础研究,着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题,论述其应用前景

1.电子信息杂交策略及其在猪基因组研究中的应用现状

电子信息杂交策略是依据比较基因组定位结果，充分利用猪EST（expressedsequencetag,EST）数据库的信息资源，借助计算机辅助进行基因的克隆，又称为“siliconcloning”。

其基本原理是利用研究深入、标记稠密的哺乳动物基因组保守功能基因的编码区序列（CDS）作为信息探针，在猪EST数据库筛选同源EST（s）（标准：

长度≥100bp，同源性75%～95%），排除已克隆EST（s）后进行拼接，设计引物获取基因（cDNA）全长（Altschul等，1990；Mao等，1998；A田芳等，2000；Cirera等，2000）。

该方法的特点是：

（1）是建立在生物信息学分析的基础上，进行同源性比较和计算机辅助克隆新基因，具有快速、简便、直接等优点；

（2）因为该方法在选择候选基因时有很强的目的性，是一种与定位克隆、定位候选克隆策略并列的比较候选基因法；（3）由于该方法是利用的是EST即cDNA部分序列信息，因而能够获得基因（cDNA）全长（Liang等，2000）。

利用电子信息杂交策略在分离猪基因中的应用才刚起步（Cirera等，2000），但该方法在人及其它动物基因分离中已经有广泛的应用（Mao等，1998；Bolognese,等，2000；毕安定等，2000；范玉新等，1999），由此可见，利用电子信息杂交策略分离猪基因将具有良好的应用前景，在国内开展十分必要。

2.猪12号染色体上基因及遗传与物理的研究现状与不足

12号染色体是猪基因组中最小的中部着丝粒染色体，1999年2月22日申请者在网上检索到的猪12号染色体上遗传与物理图谱现状如图1、图2、图3。

收录到猪12号染色体上的基因和标记共57个，其中功能基因26个，微卫星标记31个。

功能基因有：

ALOX12（二十碳四稀酸-12-脂氧合酶，arachidonate12-lipoxygenase）；CDC42（GTP结合蛋白，porcineEST,GTPbindingprotein）；EAD（红细胞抗原D，erythrocyteantigenD）；GH1（生长激素，growthhormone）；HOXB6（同源框B6，HomeoboxgeneB6）；NME1（Nm23protein）；INHBB（抑制素β亚基，Inhibin,betasubunit）；KICT（细胞骨架角蛋白类型I，KeratintypeI,cytoskeletal）；MCP（单核苷酸趋化蛋白，Monocytechemoattractantprotein）；PRKAR1A（cAMP依赖性蛋白激酶调节亚单位类型1A，cAMP-dependentproteinkinaseregulatorytype1alpha）；POLR2（大多肽RNA聚合酶Ⅱ,largepolypeptideRNApolymeraseII）；TK1（可溶性胸苷激酶1,thymidinekinase1,soluble）；TP53（肿瘤蛋白53,tumourproteinp53）；UMPH2（尿苷酸磷酸水解酶2,uridine5'-monophosphatephosphohydrolase2）；MAP2C（微管相关蛋白2，microtubuleassociatedprotein2）；ACACA（乙酰辅酶A羧化酶，acetyl-coAcarboxylase）；MYH2（肌球蛋白重链2，myosinheavychain2）；GAS（胃泌素，gastrin）；PNMTP（苯基乙醇胺—N—甲基转移酶，phenylethanolamineNmethyltransferase）；LPO（乳过氧化物酶，lactoperoxidase）；PAX8（成对盒同源蛋白8，pairedboxhomoprotein8）；MYH1（骨骼肌肌球蛋白重链，skeletalmyosinheavychain）；GRB2（生长因子受体结合蛋白2，growthfactorreceptor-boundprotein2）；D20238（humanEST）；H01962（humanEST）；Z94858（porcineESTb9）。

微卫星标记有：

S0083，S0090，S0096，S0106，S0143，S0147，S0229，SW1307，SW1350，SW1553，SW168，SW1936，SW1956，SW1962，SW2180，SW2490，SW2494，SW2559，SW37，SW467，SW60，SW605，SW62，SW874，SW943，SW957，SWC23，SWR1021，SWR1802，SWR390，X11004。

与1999年2月22日检索结果比较，新增加了12个功能基因，而1998年3月至1999年2月22日检索结果只增加了一个功能基因，由此可见，猪12号染色体上基因和标记的定位进展正逐渐加快。

另外随着快捷有效的定位工具如体细胞杂种克隆板（somaticcellhybridpanel）和体细胞辐射杂种板（porcineradiationhybridpanel）的应用，将极大的提高猪基因定位的速度（Rothschild,2001）。

尽管于此，猪12号染色体上已知基因及微卫星DNA标记仍然偏少，仍需加强分离、鉴定猪12号染色体上新基因的研究力度。

据研究结果，猪号染色体12的相对长度约占整个基因组的3%至3.2%（Liu等，1997年），哺乳动物基因组中一般大约有10万个左右的功能基因，由此可粗略推算猪12号染色体应有3000个左右的基因，由此可见猪12号染色体基因分离克隆工作仍需加强，猪12号染色体遗传与物理图谱还有待充实。

3.猪12号染色体比较基因定位研究现状

哺乳动物比较基因组学研究揭示猪12号染色体与人整条17号染色体同源，与小鼠11号染色体之间存在大的染色体同源片段（Lalley等，1989；Davission等，1991），并且猪与人之间基因组的保守程度比人与鼠相互之间的高（Johansson等，1995）。

猪12号染色体占猪基因组的3.5%，对应于人17号染色体，占人基因组的2.7%（http:

//www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/compare/table.htm）。

因此可以充分利用定位于人17号染色体和小鼠11号染色体上的基因信息，可以加快分离和鉴定猪12号染色体上与猪重要经济性状有关的基因的速度（Rothschild,2001），这也是本申请项目的一个立论依据。

据此，我们选取在猪基因组中尚未分离的且具明显生理功能的定位于人17号染色体和小鼠11号染色体上，对应于猪12号染色体的20个基因作为本申请项目的候选基因。

4.猪12号染色体基因的重要生理功能分析现状

目前，研究影响猪重要数量性状的基因或其DNA标记已成为国内外研究热点，并有一些研究进展。

在猪12号染色体功能基因中，与猪经济性状有关的有GH基因（Nielsen等，1995；Knorr等，1997；Yue等，2000）。

近期研究也发现ADD1（adipocytedeterminationanddifferentiationfactor-1）可能与肉质性状有关（Emnett等，2000）。

此外，我们研究还初步显示PRKAR1A基因与二花脸和杜洛克猪的某些经济性状有关（删）。

从比较基因定位的分析结果看，猪12号染色体上的基因有重要的生理功能，应具有一大批与生长、发育、疾病相关的基因有待分离鉴定。

因此，分离鉴定猪12号染色体上的新基因不仅必要，而且有希望筛选出与猪重要经济性状有关的基因标记。

5.本项目的学术思想

根据比较基因组学的研究思路，充分利用GenBankEST数据库信息，采用具有明显优点的电子信息杂交筛选策略，快速分离和鉴定猪12号染色体上新的功能基因，并研究其结构特征、组织表达谱和遗传与物理定位以及基因效应，该研究将对于进一步阐述猪12号染色体的结构、功能、进化以及基因克隆、数量性状基因座（quantitativetraitloci，QTL）定位均具有重要意义，对于提高我国在国际基因知识产权争夺战中的竞争力具有积极作用。

6.本项目的意义

5.1本项目拟分离和鉴定的候选基因具有重要的生理功能

我们借助人和小鼠基因组研究结果，利用比较候选基因方法，初步选定20个可能与猪的生长、发育、抗病等性状有关，参与调节生理生化反应的基因进行分离和鉴定。

如ASPA、CTNS、ICAM2、P2X5、PMP22等与免疫和抗病性能有关（Town等，1998；Kaul等，1994；Donald等，1989；Le等，1997；Edomi等，1993），ENO3与骨骼肌和心脏的发育调节有关（Agata等，1993），PSMD12、PSMC5与细胞凋亡、信号转导及应急性有关（Akihiko等，1997），ACRP和HSS与繁殖性能有关（Mao等1998；Shankar等，1998），GTPBIP、GNGT2、APOH则具有调节重要生理生化反应的能力（Schenker等，1994；Ong等，1997；Day等，1992）。

鉴于上述候选基因均具有重要的生理功能，研究其与猪某些数量性状的关联是很有必要的。

5.2本项目的顺利实施将对我国参与国际猪基因知识产权争夺具有重要意义。

基因及DNA标记具有重要的的商业价值，基因的专利被文明加以保护，这意味着基因具有很大的经济利益（陈越等，2000年）。

随着国际人类和动物基因组研究计划研究的深入发展，已逐步演变为一场基因知识产权的争夺战。

因此有必要分离鉴定新基因的研究进度。

本申请项目利用GenBank数据库的现存信息，从EST即cDNA部分序列入手，通过同源筛选，直接搜寻新基因不失为一种在“基因抢夺战”中获胜的捷径（田芳等，2000），将对我国参与国际猪基因知识产权争夺具有重要意义。

5.3利用猪参考家系分析新基因与经济性状的关联，将为我国开展标记辅助选择进行猪的遗传改良起积极作用。

5.4本项目将丰富猪12号染色体的遗传与物理图谱，加深对猪基因组结构的认识。

5.5本项目研究将可能加深对猪12号染色体起源进化的认识。

5.6本项目是本室前国家自然科学基金的进一步深入。

本室在前国家自然科学基金项目资助下，已围绕猪12号染色体上基因从细胞和分子水平已做了大量较系统的研究工作，在猪12号染色体研究中已经形成了一定的特色和优势，因此本项目的申请是建立在前国家自然科学基金研究所奠定的理论和技术基础及研究成果基础上（详见工作基础部分），是前国家自然科学基金的进一步深入。

因此，本项目的研究具有重要的科学与实践意义。

7.主要参考文献

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三、研究方案

1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1.1.研究目标

1.1.1从选定的20个候选基因中，完成猪12号染色体上5—7个新的功能基因的全长cDNA（或近全长cDNA）的分离和鉴定。

1.1.2分析上述cDNA的结构特征。

1.1.3利用参考家系分析上述新基因的遗传规律及与经济性状的关联。

1.2研究内容

1.2.1选取位于人17号染色体上和小鼠11号染色体上的20个候选基因（候选基因的名称和选取办法见2.1.1），以上述候选基因的编码区的保守序列作为信息探针，用美国国家生物信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI）提供的BLASTN和BLASTP对GenBank的猪EST数据库进行电子信息杂交筛选，获得高度同源的猪ESTs，构建EST重叠群，根据EST重叠群信息设计引物，结合RT-PCR和阻抑性RACE（阻抑性cDNA末端快速扩增，SuppressionrapidamplificationofcDNAends）方法获取上述候选基因的同源基因全长cDNA（或近全长cDNA）。

1.2.2通过DNA序列测定、同源性比较、结构特征分析及遗传与物理定位等方式进行鉴定和确证。

1.2.3利用猪参考家系的性状测定资料，分析新分离基因与经济性状的可能关联。

1.3拟解决的关键问题

1.3.1利用电子信息杂交筛选方法，分离、鉴定和定位猪12号染色体上5—7个新功能基因和功能基因主要片段，试图在国内建立一种快速获取猪功能基因的新方法。

1.3.2通过分析上述新分离的猪功能基因的结构特征、遗传规律和与经济性状的关联，旨在为MAS和MAI育种新技术寻找新的分子标记。

1.3.3本研究的技术关键及解决办法详见

2.拟采取的研究方法,技术路线,实验方案及可行性分析

2．1研究方法、技术路线和实验方案

2.1.1猪12号染色体新功能基因cDNA的分离和鉴定

（1）电子信息杂交筛选。

从GenBank数据库中选取位于人17号染色体上和小鼠11号染色体上的20个候选基因，分别是：

PSMD12（proteasome（prosome,macropain）26Ssubunit,12;蛋白酶体26S亚单位12），EEF1D（eukaryotictranslationelongationfactor2delta（guaninenucleotideexchangeprotein）;真核翻译延长因子2γ（鸟嘌呤核苷酸交换因子）），RGS9（regulatorofG-proteinsignaling9;G蛋白信号9调节物），PSMC5（proteasome（prosome,macropain）26Ssubunit,5;蛋白酶体26S亚单位5），MAPT（microtubule-associatedproteintau;微管相关蛋白τ），SDF1（stromalcell-derivedfactor1;基质细胞衍生因子1），ACRP（spermacrosomalprotein;精子顶体蛋白），GTPBIP（GTP-bindingprotein;GTP结合蛋白），HSS（spermprotein;精子蛋白），GNGT2（G-proteingammasubunit;G蛋白γ亚单位），ICAM2（intercellularadhesionmolecule2;细胞间粘着分子2），APOH（apolipoproteinH;载脂蛋白H），BECN1（beclin1（coiled-co