简析分子生物技术在厌氧氨氧化工艺研究中的应用.docx

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简析分子生物技术在厌氧氨氧化工艺研究中的应用

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　　厌氧氨氧化（anammox）工艺是由荷兰Delft大学于1990年研究开发，并在实际废水处理中得到成功应用的一种新型废水生物脱氮工艺。

它以anammox反应为基础，该反应依靠厌氧氨氧化菌（AnAOB）特殊的代谢机制，在厌氧条件下，以氨为电子供体，亚硝酸盐为电子受体反应生成氮气。

Anammox工艺以高效低耗的优势在废水生物脱氮领域具有广阔的应用前景。

然而，由于AnAOB倍增时间很长（11d），迄今为止仍未获得AnAOB的纯培物，且anammox反应器中微生物的种类、丰度及相互之间的关系一直被认为是黑匣子，所以传统的微生物分析方法———基于纯培物的分离进行形态、代谢、生化和遗传分析的方法，受到了很大的限制。

　　20世纪90年代发展起来的一套新的分子生物技术彻底改变了微生物学研究，与传统的研究方法不同的是，它不需要将微生物分离就可以鉴别特定种群，已成为微生物生物学特性研究的新平台。

分子生物技术近年来发展迅速，尤其在anammox工艺等废水脱氮研究领域崭露头角，它基于有“分子进化钟”之称的小核糖体亚基的RNA（原核生物为16SrRNA）及其相应的基因进行研究。

在这些技术中，DGGE、FISH、qPCR、高通量测序和基因芯片等以独特的优势脱颖而出，具有一定的代表性。

DGGE、FISH和高通量测序技术能够将anammox工艺中微生物的种类、丰度及群落关系可视化，qPCR可以作为指示参数直接监测反应器内AnAOB的数量变化，同时，基因芯片（GeoChip）能够将微生物群落结构与功能紧密结合，这对于全面认识厌氧氨氧化菌的性质，解析厌氧氨氧化工艺的微生物学机理，快速启动anammox工艺及提高其性能的有重要意义。

　　文章重点介绍了DGGE、qPCR、FISH、高通量测序和基因芯片等分子生物技术在anammox工艺研究的应用，并总结其主要的优缺点。

这些技术最近已经开发，主要用于实验室规模，在不久的将来，这些技术会成为设计和管理生产规模anammox工艺的评估工具。

　　1变性梯度凝胶电泳

　　分子指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（DGGE），温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）和末端限制性片段长度多态性分析（Terminal-restrictionfragmentlengthpolymor-phism，T-RFLP），在这些技术中，较为常用的是DGGE。

根据DNA分子在不同梯度的变性剂中解链行为的不同而具有不同电泳迁移率的特点，将片段大小相等而碱基组成不同的DNA片段分开，每个条带代表一个微生物种类，DGGE产生的结果可以直接反映群落多样性。

同时，也可以通过回收目的条带进行片段测序获得系统发育信息。

　　目前，已发现并鉴定的AnAOB有6属19种（表1），其中大部分AnAOB分离自污水处理厂或实验室反应器样品，少部分分离自海水样品，但均没有获得纯培物。

Strous等最早采用PCR-DGGE技术鉴定一种新的AnAOB，并命名为CandidatusBrocadiaanammoxidans。

Schmid等基于PCR-DGGE方法在德国几个污水处理厂发现了新的16SrRNA序列，与已发现的CandidatusBrocadiaanammoxidans的16SrRNA序列相似性小于90%，因此，这种新的AnAOB被命名为CandidatusKueneniastuttgartiensis。

Park等研究了不同接种源和运行方式对anammox反应器中微生物群落的影响，通过PCR-DGGE分析发现，随着序批式反应器（SBR）稳定运行，其中AnAOB的优势菌从CandidatusKueneniastuttgartiensis转变为CandidatusBrocadiafulgida和CandidatuBrocadiasp.40，全程自养脱氮反应器（CANON）也逐渐以CandidatusBrocadiasp.40为优势菌，结果表明反应器中接种源和运行方式对AnAOB优势种的选择不大重要。

结合PCR技术，DGGE可以简单分析出反应器中菌群的种类，可以作为AnAOB富集简单的检测指标。

　　2荧光原位杂交

　　核酸杂交法利用短的寡核苷酸探针（约15~25bp）特异性结合目标核酸，从而检测原位或非原位细胞。

斑点印迹法是一种非原位方法，通过评估基因表达水平的相对变化来探究一个群落的代谢活动，然而由于基因表达模式与环境条件显著相关，这种技术用于微生物量化有一定的局限性。

荧光原位杂交（FluorescenceinSituHybridization，FISH）是用荧光标记的已知核苷酸序列的探针在细胞内和特异的互补核酸序列杂交，通过激发的荧光信号来检测样品的方法。

基于其原位的性质，通过荧光显微镜成像，可分析反应器中AnAOB群落的丰度和分布。

由于不需要提取核酸，近年来该方法广泛应用于anammox工艺诊断中。

　　目前FISH中使用的寡核苷酸探针主要依据16SrRNA分子的核苷酸序列来设计，长度一般为15~30bp，通常在寡核苷酸探针的5′端通过共价键与荧光染料相连。

表2列举了用于AnAOBFISH实验的寡核苷酸探针。

视化，作为AnAOB的鉴定方法的同时，在一定程度上能真实地反映anammox颗粒污泥内部微生物的组成和空间分布情况。

基于16SrRNA基因的靶向探针，vanderStar等对生产规模反应器启动的不同阶段进行研究，结果表明CandidatusBrocadia一直是anammox颗粒污泥的优势菌种，Guven等通过FISH证实了连续搅拌反应器（CSTR）中的优势菌种为CandidatusBrocadiaanammoxidans。

Third等用体积分数为10%的氨氧化菌接种到厌氧氨氧化反应器中以启动全程自养脱氮工艺，通过特异性FISH探针鉴定了富集产物AnAOB，并在anammox富集物中发现了新的AnAOB。

Rincón等提出用于研究anammox工艺的分子生物技术，包括FISH和浮霉菌门特异性PCR。

Hu等使用Cy3标记的Amx820探针和DAPI对8个anammox反应器中的AnAOB进行检测和定量，FISH结果显示8个反应器中只有一种AnAOB占优势，研究表明同一接种源可用于接种处理不同污水的反应器，有利于生物反应器的快速启动。

近两年，FISH在anammox工艺中的应用已接近成熟，通过多种探针结合，FISH图片可以清晰反映反应器中AnAOB群落的变化，从而为改善工艺性能提供依据。

　　Lotti等研究了流化床颗粒污泥反应器中温度的降低（从20℃到10℃）对微生物群落的影响，通过FISH图片可以清晰地观察到AnAOB在总菌中的比例逐渐增大，随着温度的降低，有机物逐渐消耗，但异养菌不能战胜AnAOB成为优势菌群，同时也表明AnAOB在市政废水低温处理过程中有一定的优势。

由于能直观反映AnAOB的分布而不破坏微生物的原位生态结构，灵敏度高，探针能长时间保存等优点，FISH技术在微生物群落解析中得到广泛应用，技术水平也逐渐成熟。

但是仍然有其不足之处：

（1）在检测和定量前，需要知道目标菌群16SrRNA序列;

（2）一方面，随着AnAOB的不断发现，已有的探针不足以测定所有的AnAOB，探针需要不断更新;另一方面，新探针的设计以及杂交条件的优化比较困难;（3）荧光信号弱、清晰度差;（4）对于生长缓慢的AnAOB，由于其rRNA含量低而很难被探测到。

尽管如此，随着研究人员的不断努力及技术的不断进步，FISH将会有更强的实用性和可操作性，并且随着AnAOB新探针的研发，能更深入了解anammox工艺的微生物学机理。

　　3实时荧光定量PCR

　　实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qPCR）技术通过荧光信号对PCR进程进行实时监测，因其灵敏度高，操作简单方便，实时性和准确性，已广泛应用于反应器内微生物的定量分析。

用于定量检测的荧光分子有多种，包括非特异性DNA结合染料，水解探针，杂交探针，发光探针和分子信标等。

尽管每一种检测方法有其独特性，但在所有的方法中，荧光信号的水平均反映目标扩增子的积累量。

其中，SYBRGreenI和TaqManassays是当前研究中最为广泛使用的方法。

Anammox反应器的启动过程，实际上就是AnAOB的富集积累的过程，但AnAOB生长缓慢，阻碍了anammox工艺的推广应用，为了克服这种限制，以16SrRNA基因和特异性功能基因作为标记的qPCR方法得到广泛应用。

　　Tsushima等首次将qPCR应用于anammox工艺中。

作者使用生物转盘富集AnAOB，基于富集物的16SrRNA基因序列，设计了一对用于厌氧氨氧化菌定量的引物，并且使用SYBRGreenI得到成功应用。

厌氧氨氧化菌16SrRNA基因丰度的增加与氮去除率的增加显著相关。

qPCR的结果估算富集培养物中厌氧氨氧化菌的倍增时间为~d。

这一研究表明qPCR是评估anammox工艺中AnAOB生长状态极为有价值的方法。

　　vanderStar等也做了早期的研究，由于反应器启动阶段厌氧氨氧化菌活性较低不能用传统的方法鉴定，因此作者用qPCR来监测厌氧氨氧化厌氧氨氧化菌的生长，同时研发TaqMan探针进行qPCR的检测方法，并且证明了这种定量方法的可靠性从qPCR监测结果来看，生物量倍增时间为9~17d。

此研究提供的分析方法可能对厌氧氨氧化反应器的设计和运行有用。

　　作为微生物群落分析的手段，通过使用特异性寡核苷酸引物对目标菌群进行定量，qPCR在anammox工艺研究中的优越性愈显突出。

在anammox工艺中，实时监测对评估微生物群落动态，提高工艺性能，鉴别优势微生物种群至关重要。

qPCR是目前计算目标基因拷贝数最精确的方法。

虽然，从理论上讲，qPCR可以特异性地检测到任何目标序列，但特异性和灵敏性的分析主要受引物特异性影响。

因此，在anammox反应器这样的混培体系中，特异性引物的设计对分析至关重要。

同时，样品中核酸提取效率、寡核苷酸引物的特异性以及无活性DNA的扩增等可能引起目标序列低估或高估。

总之，在理解局限性因素的基础上，qPCR定量必须要精心设计、实验和验证，才能更好地应用于anammox工艺研究。

　　4基因芯片

　　基因芯片是在基因探针的基础上研制出的一种小型化的DNA阵列，又称DNA微阵列（DNAmicroarray）。

通过基因芯片可对目标序列测序，步骤如下：

（1）将大量已知的DNA探针集成于固体基质的表面，产生二维DNA探针阵列。

（2）将荧光标记后的目标序列与之杂交。

（3）检测杂交信号，对生物样品的大量基因进行分析。

用于anammox工艺研究的基因芯片主要是功能基因芯片（GeoChip）。

GeoChip能够将微生物群落的结构和功能紧密结合，与高通量测序技术相互补充，可用于研究anammox反应器中微生物群落功能结构和代谢功能。

　　最新版本的功能基因芯片GeoChip对应410个功能基因类别，包括氮循环、碳循环、重金属抗性、有机修复和应激反应在内的152414个功能基因，是一种强有力的微生物群落功能基因分析工具。

Zhao等将GeoChip应用到一体式短程硝化-anammox反应器微生物群落检测中，该反应器用于处理厌氧消化上清液（含高浓度氨氮污染物），经过对基因丰度和多样性分析发现，在运行稳定的生物反应器中微生物群落随环境条件的变化有明显的不同，功能基因的多样性随消化上清液百分比的增多而减少，与有机修复和重金属抗性相关的基因丰度较高，anammox相关基因丰度相对稳定。

结果表明含氮化合物、碳氮比以及运行参数（pH和温度）是决定反应器中微生物群落结构的关键变量，这也为工艺稳定运行提供重要信息。

基因芯片技术经过多年的发展形成了一个系统平台，积累了大量的公共数据。

它适合对未获得纯培物的AnAOB进行已知信息的检测，同时能够将反应器中微生物群落结构与功能结合起来进行分析;基于成熟完整的基因芯片分析理论，便于对数据进行分析。

然而，这样的高通量快速检测技术也存在一些缺点，例如，它只能对已知序列进行检测，不能用于寻找新基因，而这对于未知AnAOB的探究是非常有必要的。

高通量测序能弥补这一缺陷，通过高通量测序获取新基因信息，同时利用基因芯片对这些信息进行高通量、低成本快速检测，从而在短时间内获得大量有效数据。

　　5总结与展望

　　从微生物学角度来讲，Anammox工艺的运行是AnAOB驯化富集的过程，因此，AnAOB的群落动态，群落数量及群落结构决定了反应器脱氮性能。

分子生物技术的应用扩大了微观层面上对anammox污水处理系统的理解，通过分析anammox工艺运行与微生物群落结构的关系，有助于了解anammox反应脱氮机理，优化反应器运行性能，并提高对反应系统的管理。

然而，必须考虑应用时的限制性因素，虽然在不久的将来不太可能避免，但是应该尽量了解并克服这些限制因素，从而探索出真实的群落结构动态。

不同的技术各有千秋，采用DGGE、qPCR和高通量测序技术解析不同运行条件下反应器中AnAOB的群落结构和数量的动态变化，FISH将这一过程可视化，GeoChip能够将群落结构与功能结合。

实际应用中，往往根据不同的目的择优选择或者将多种技术结合使用，同时只有将这些技术与设计思路完美结合，才__能够更好地服务于工程研究。

　　今后应努力的方向是：

（1）改善传统的微生物学方法，结合现代分子生物技术分离鉴定出更多有实际应用价值的AnAOB。

（2）研究anammox工艺中AnAOB和其它细菌之间的协作和竞争机制，阐明微生物群落结构及调节机制。

（3）深入研究厌氧氨氧化菌的基因组学和蛋白质组学，改良厌氧氨氧化工艺的运行条件。

相信随着技术的不断进步以及实验条件的不断优化，在不久的将来，这些技术会成为设计、跟踪和调控生产规模anammox工艺的有效工具。

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