无菌检查法标准操作程序.docx

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无菌检查法标准操作程序

文件名：

无菌检查标准操作程序

编号：

SOP-QC-1101-A3

起草人：

审核人：

批准人：

起草日期：

审核日期：

批准日期：

颁发部门：

质量管理部

发布日期：

实施日期：

分发范围：

QC

1目的

建立一个无菌检查法标准操作程序，保证实验的准确性、可靠性。

2范围

适用于原料、辅料及成品的无菌检查。

3职责

微生物检验员遵照执行。

4内容

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

4.1培养基

硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。

4.1.1培养基的制备及培养条件

培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2〜25°C、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

4.1.1.1硫乙酵酸盐流体培养基

胰酪胨15.0g氯化钠2.5g

酵母浸出粉5.0g新配制的0.1%刃天

无水葡萄糖5.0g青溶液1.0ml

L-胱氨酸0.5g琼脂0.75g

硫乙醇酸钠0.5g水1000ml

（或硫乙醇酸）（0.3ml）

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH,使灭菌后在25℃的pH值为7.1土0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100°C水浴加热至粉红色消失（不释过20分钟），迅速冷却只限加热一次，并防止被污染。

除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30〜35C培养。

4.1.1.2胰酪大豆胨液体培养基

胰酪胨17.0g氯化钠5.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氢二钾2.5g

葡萄糖/无水葡萄糖2.5g/2.3g水1000ml

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。

胰酪大豆胨液体培养基置20〜25℃培养。

4.1.1.3中和或灭活用培养基

按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。

4.1.1.40.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）

胨10.0g氯化钠5.0g

牛肉浸出粉3.0g水1000ml

葡萄糖5.0g

除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。

4.1.1.5胰酪大豆胨琼脂培养基

胰酪胨15.0g琼脂15.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g水1000ml

氯化钠5.0g

除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3士0.2，加入琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。

4.1.1.6沙氏葡萄糖液体培养基

动物组织胃蛋白酶水解物水1000ml

和胰酪胨等量混合物10.0g

葡萄糖20.0g

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6士0.2，加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。

4.1.1.7沙氏葡萄糖琼脂培养基

动物组织胃蛋白酶水解物琼脂15.0g

和胰酪胨等量混合物10.0g水1000ml

葡萄糖40.0g

除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为5.6士0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。

4.1.2培养基的适用性检查

无菌检查用的硫乙醉酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。

本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

4.1.3无菌性检查每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

4.1.4灵敏度检查

4.1.4.1菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）〔CMCC（B）10104〕

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕

白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕

黑曲霉（Aspergillusniger）〔CMCC（F）98003〕

4.1.4.2菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35°C培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20〜25°C培养24〜48小时，上述培养物用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数小于l00cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，加入3〜5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨醋80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数小于l00cfu的孢子悬液。

菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8°C可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2〜8℃，在验证过的贮存期内使用。

4.1.4.3培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于l00cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。

逐日观察结果。

4.1.4.4结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

4.2稀释液、冲洗液及其制备方法

稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

4.2.10.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨l.0g，加水1000ml,微温溶解，滤清，调节pH值至7.1士0.2，分装，灭菌。

4.2.2pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g,氯化钠4.30g,蛋白胨l.00g，加水1000ml,微温溶解，滤清，分装，灭菌。

根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

4.3方法适用性试验

进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。

方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。

对每一试验菌应逐一进行方法确认。

4.3.1菌种及菌液制备除大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。

大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。

4.3.2薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于l00cfu的试验菌，过滤。

加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。

另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。

置规定温度培养，培养时间不得超过5天，各试验菌同法操作。

4.3.3直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙酵酸盐流体培养基6管，分别接入小于l00cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入小于l00cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。

其中1管接人每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5天。

4.3.4结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。

方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

4.4供试品的无菌检查

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。

只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。

供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。

无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。

4.4.1检验数量检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量，成品每亚批均应进行无菌检查。

除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2规定。

表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。

4.4.2检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。

除另有规定外，供试品检验量按表3规定。

若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。

采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

4.4.3阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：

无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。

阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。

阳性对照管培养72小时内应生长良好。

4.4.4阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。

阴性对照不得有菌生长。

4.4.5供试品处理及接种培养基

操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导人无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。

除另有规定外，按下列方法进行供试品处理及接种培养基。

4.4.5.1薄膜过滤法

薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器。

无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。

根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜6油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。

4.4.5.1.1水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合至含不少于100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。

如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。

除生物制品外，一般样品冲洗后，1份滤器中加人100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器中加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

生物制品样品冲洗后，2份滤器中加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器中加人100ml胰酪大豆胨液体培养基。

4.4.5.1.2水溶性固体供试品取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。

4.4.5.1.3非水溶性供试品取规定量，直接过滤；或混合溶于适量含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。

用含0_1%〜1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。

加人含或不含聚山梨酯80的培养基。

接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。

4.4.5.1.4可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44°C,趁热迅速过滤。

对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加人不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。

过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

4.4.5.1.5无菌气（喷）雾剂供试品取规定量，将各容器置一20°C或其他适宜温度冷冻约1小时，取出，以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试品转移至无菌容器中混合，供试品亦可采用其他适宜的方法取出。

然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

4.4.5.1.6装有药物的注射器供试品取规定量，将注射器中的内容物（若需要可吸人稀释液或标签所示的溶剂溶解）直接过滤，或混合至含适宜稀释液的无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性供试品项下方法操作。

同时应采用适宜的方法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。

4.4.5.1.7具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品取规定量，每个最小包装用50〜100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。

同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。

4.4.5.2直接接种法

直接接种法适用于