蔗糖酶的提取分离纯化及活性检测.docx
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蔗糖酶的提取分离纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
摘要
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词
啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km
前言
生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：
①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：
一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
在一定的溶解度范围内许多蛋白质和酶均可盐析出来。
其次，它的价格便宜，分级效果好且不容易引起蛋白质变性，在一定程度上还有稳定作用。
有机溶剂沉淀法能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的斥力，导致溶解度的降低。
另外，有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶液中便沉淀析出。
在分离纯化的过程中，往往需要几种方法的合理结合，方法选择的好，前后串联得当，可大大提高整个分离提纯过程的速度和收效。
在分离提纯过程中，应该尽量避免引起蛋白质变性的各种因素，此外，在分离提纯前，必须建立对酶的分析鉴定方法，以正确指导分离提纯地进行。
材料与方法
1.材料
啤酒酵母（兰州黄河啤酒有限公司）
2．方法及步骤
2.1葡萄糖浓度标准曲线的制作：
取22支编号的试管（两个平行）按下表的顺序加入0.2%Glc溶液，水及3,5-二硝基水杨酸试剂。
然后在沸水浴中加热5分钟，然后立即用自来水冷却并用蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm测光密度，结果如下表所示：
管号
含糖量（ug）BG溶液
0.2%Glc标准液（ml）
水（ml）
3.5-二硝基水杨酸试剂（ml）
OD540nm
平均OD540nm
1
0.0
0.0
2.0
1.5
0.0
0.0
0.0
2
0.4
0.2
1.8
1.5
0.065
0.073
0.069
3
0.8
0.4
1.6
1.5
0.153
0.167
0.160
4
1.2
0.6
1.4
1.5
0.257
0.185
0.221
5
1.6
0.8
1.2
1.5
0.346
0.334
0.340
6
2.0
1.0
1.0
1.5
0.443
0.429
0.436
7
2.4
1.2
0.8
1.5
0.508
0.506
0.507
8
2.8
1.4
0.6
1.5
0.594
0.602
0.598
9
3.2
1.6
0.4
1.5
0.669
0.658
0.664
10
3.6
1.8
0.2
1.5
0.766
0.753
0.760
11
4.0
2.0
0.0
1.5
0.850
0.818
0.834
2.2标准蛋白曲线的制作
取11支编号的试管，分别准确加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分别加入1.5ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，摇匀，放置3min后，在595nm比色读取OD值，结果如下表所示：
试管号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
标准蛋白浓度（ug/ml）
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
牛血清白蛋白标准液（ml）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
水（ml）
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂（ml）
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
OD595nm
0.0
0.018
0.054
0.124
0.188
0.231
0.308
0.340
0.433
0.580
0.705
0.0
0.015
0.038
0.135
0.186
0.219
0.365
0.344
0.482
0.576
0.601
平均OD595nm
0.0
0.0165
0.046
0.129
0.187
0.225
0.336
0.342
0.457
0.578
0.653
2.3转化酶的纯化
2.3.1粗品的制备和乙醇分级沉淀
2.3.1.1自溶
用台秤称取40g的新鲜啤酒酵母放在250毫升三角瓶中，再分别放入1.2克乙酸钠细粉末、20毫升甲苯。
然后在35℃水浴中间隔片刻震荡、保温30分钟，此时会观察到菌体自溶现象。
2.3.3.2抽提及粗酶的制备
往上述自溶液中加入60毫升水，于35℃保温过夜。
第二天，将自溶液于4000RPM*15min离心。
取出离心管后分三层：
下层透明，中间为蛋白层，上层为有机层。
用吸液管将最上层的甲苯吸去，然后可再用一药勺挡住块状粘稠物，倾斜离心管倒出上清液。
弃去粘稠物。
此时会有一些悬浮物存在。
再离心一次（4000RPM*20min），如上清液已滤清，小心倒入250毫升烧杯中。
得到的溶液就是无细胞抽提液即粗酶液。
量出粗酶液的体积VE1=42ml，从中取出1毫升置0—4℃保存，将待测酶活力和蛋白浓度，其余供下步继续纯化用。
2.3.3.3乙醇分级沉淀
先用10%的乙酸调粗酶液pH在4.4—4.6之间，记录加入10%乙酸的体积。
⑴32%乙醇饱和度
按下列的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达到32%时所需乙醇体积。
X1/V+X1=0.32
其中V=44ml，需要加入95%的乙醇体积：
X/0.95=22ml
注意：
在滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线。
滴加结束后，于4000RPM*5min。
上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。
⑵47.5%的乙醇饱和度
按下式算出使酶液乙醇浓度达到47.5%时所需乙醇的量。
X2/V=X2=0.475
需要加入95%的乙醇体积X2/0.95=44ml
按下式算出使酶液乙醇浓度达到47.5%所需补加的乙醇的体积。
X2/0.95-X1/0.95=22ml
然后静置10min，于4000RPM*10min，弃去上清会得少量沉淀。
将沉淀用10ml，pH6.0，0.005MPBS溶解（10mlPBS应分2-3次充分溶解），装入自制的透析袋中，并作一标记，将透析袋放入盛有pH6.0，0.005MPBS的烧杯中进行透析，时间为2-3小时（中间要换一次透析液，并置冰箱中进行透析）。
透析后将透析酶液离心，4000RPM*5min，取上清，量体积即为E2并留1ml（0-4℃保存）待测酶活力及蛋白浓度，其余酶液上DEAE-Cellulose柱。
VE2=
2.3.2第一次纯化
2.3.2.1装柱
本实验使用的层析柱的规格是1.5cm（内径）*20cm（高）。
把柱子垂直固定好。
将DEAE-Cellulose装柱，床高距柱顶2cm为宜。
2.3.2.2柱的平衡
装好柱后，用起始缓冲液（pH6.0,0.005MPBS），平衡流速成4ml/5min。
目的是交换剂上的平衡离子全部变成起始缓冲液的相应离子。
另一方面，在流洗柱的过程中，也可以使交换剂床紧密，从而提高分离效果。
平衡洗柱的流出体积至少应是床体积的5倍左右。
2.3.2.3上样
将柱中多余液体放出后，将3ml样品小心加到层析柱中，打开流速夹，使样品液流入柱内。
然后加pH6.0,0.005MPBS150ml洗柱。
此流出液理论上应不含我们所需要的酶，因此可不必收集，但必须检查是否有酶活力存在。
2.3.2.4洗脱
待150mlPBS洗完后，改换含0.1MNaCl的pH6.0,0.005MPBS洗脱（此处洗下来的是我们所需的酶），流速为0.6-0.8ml/min，每管收集5ml，收集5-7管后，改换含0.2MNaCl的pH6.0,0.005MPBS洗脱，收集至经检查无酶活力为止。
2.3.2.5酶活力的检测
取试管若干支，编号，各加入2ml5%蔗糖（pH4.6）每间隔一管取0.05ml收集液，按先后顺序分别加入上述含2ml5%蔗糖的试管中混匀，置35℃水浴10min仍以先后顺序加入0.5ml1MNaOH,立即摇匀，加入1.5ml3，5—二硝基水杨酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，转移至血糖管中，用蒸馏水稀释至25ml，塞好，摇匀。
直接目测，即可确定活力高峰范围。
合并活力高峰酶液，量体积，即得E3，从中取出1毫升置0—4℃保存，将待测酶活力和蛋白浓度。
将其余的酶液装入透析袋中，作一标记用pH6.0,0.005MPBS透析3小时（置冰箱），然后用聚乙二醇6000（PEG）将酶液浓缩至1—1.5ml，供下步用。
VE3=
2.3.3第二次纯化：
分子筛层析
2.3.3.1装柱
取已经与处理好的G-150适量，装入自制的1*25cm的层析柱中，用pH6.0,0.005MPBS平衡，流速1ml/5min,流出液体积大约为柱床体积5倍左右视为平衡好。
3.5.2上样
与一般柱层析相同，将柱中多余液体放出后，将样品小心加到凝胶柱上，打开流速夹，使样品流入柱内。
然后加pH6.0,0.005MPBS150ml洗脱，检测酶活力，确定活力高峰位置，收集活力高峰范围内的酶液，量体积，即为E4。
留1ml于4℃保存作为测定蛋白质浓度和酶活力用。
VE4=
2.4转化酶活力及蛋白质浓度的测定
2.4.1活力测定
2.4.1.1酶液稀释：
取适量无细胞抽提液（E1），用水稀释40倍；取适量乙醇分级酶液（E2）用水稀释80倍，DEAE-纤维素柱层析酶液（E3）和分子筛层析酶液（E4）根据情况稀释。
2.4.1.2反应：
取4支试管分别加入2ml稀释的酶液（每个样品平行作3份），一个空白对照加0.5ml1MNaOH，摇匀，使酶失活；另3支为测定管。
再分别加入2ml5%的蔗糖，并准确计时10min，分别加入0.5ml1MNaOH，摇匀，终止反应。
从反应混合液中取出0.5ml于血糖管中，加1.5ml3，5—二硝基水杨酸和1.5ml蒸馏水，混匀，于沸水浴中加热5min，定容至25ml摇匀，在540nm下测定吸光度。
在Glc标准曲线上找到所测光密度对应的Glc含量，然后按酶活力计算公式计算酶活力。
2.4.1.3酶活力计算公式
2.4.2蛋白浓度测定
将样品用0.005mol/LpH6.0的PBS估计稀释到2-20ug/ml范围内，取稀释的样品溶液1ml，加染色液1.5ml,2min后测Δ595值，计算蛋白质浓度。
由测得的样品OD值，查标准曲线，求得蛋白质含量，再乘以稀释倍数，即得样品蛋白质含量。
2.5蔗糖酶米氏常数—Km的测定
2.5.1取22（两个平行）支试管，编号，按下表将蔗糖液，乙酸缓冲液分别加入各管中，于35℃水浴中保温10min；
2.5.2于各管依次间隔1min加入预保温的酶液2ml，记时，立即摇匀，于35℃水浴中反应10min；
2.5.3按同样顺序和时间间隔加入0.5ml2MNaOH，摇匀终止反应；
2.5.4吸取反应液0.5ml，加入已含有3,5-二硝基水杨酸和1.5ml蒸馏水的试管中摇匀，于沸水浴加热5min，冷却后于血糖管中定容至25ml，摇匀，在540nm测定值OD。
Km的测定
酶底物反应液
活性测定
Treatmentofdatums
管号
0.1M蔗糖（Ph4.6）（ml）
乙酸缓冲液（ml）
酶液（ml
2MNaOH（ml）
吸取反应液（ml）
3，5-二硝基水杨酸（ml
H2OOD540nm（ml）
[S]
1/[S]（1/M）
OD540
平均OD540
1/V（1/OD）
1
0
2.00
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0
-
0
0
0
0
2
0.20
1.80
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.005
200
0.479
0.509
0.494
2.02429
3
0.25
1.75
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.00625
160
0.515
0.523
0.519
1.92678
4
0.30
1.70
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.0075
133.8
0.754
0.684
0.719
1.39082
5
0.35
1.65
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.00875
114.8
0.758
0.720
0.739
1.35318
6
0.40
1.60
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
100
0.795
0.868
0.831
1.20337
7
0.50
1.50
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.0125
80
1.010
0.935
0.973
1.02775
8
0.60
1.40
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.015
66.7
1.016
1.157
1.086
0.92081
9
0.80
1.20
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.02
50
1.352
1.374
1.363
0.73367
10
1.00
1.00
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.025
40
1.075
1.457
1.266
0.78989
11
1.50
0．50
2.00
0.5
0.5
1.5
1.5
0.0375
26.7
1.323
1.512
1.417
0.70572
结果与讨论
1.数据处理
葡萄糖浓度标准曲线
蛋白质浓度标准曲线
米氏常数Km的测定
2.结果分析
2.1根据图表的数据可以得到葡萄糖浓度标准曲线，根据本曲线为后面酶活力的测定提供参考，得到公式y=0.2129x-0.0086
2.2根据得到的蛋白曲线得到如下公式：
y=0.0033x-0.0627
2.3在540nm下测定吸光度结果如下:
酶 OD540 平均值
E1*120 0.839 0.9233 0.890 0.884
E2*320 0.495 0.686 0.685 0.622
E3*400 0.277 0.293 0.261 0.277
E4*300 0.253 0.248 0.211 0.237
在595nm的吸光度结果如下：
酶 OD595
E1*60 0.2230.2090.2900.241
E2*40 0.2890.3160.2810.295
E3*20 0.2770.2930.2610.277
E4*1 0.3300.3290.3260.328
2.4Km的测定，由数据得其公式为：
y=0.0093x+0.2771
横轴截距=-1/Km
得到Km=0.0336，而Km的理论值是25~28mM，所得结果明显大于理论值，估计主要原因可能是提取过程中由于没有严格在低温下操作和在离心时由于多个小组连续使用离心机，使得离心机的温度升高等多种原因，导致酶活降低。
2.5按下表要求，把各项数据整理好填入表内，并进行分析讨论
步骤
样品总体积（ml）
酶浓度（u/ml）
总活力（u）
蛋白质浓度（mg/ml）
总蛋白质量mg
比活力u/mgPr
提纯倍数
阶段收率
总收率
E1
64
5521.8
E2
4339.8
E3
5
2058.8
E4
4
190.3
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