放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究毕业设计论文.docx
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放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究毕业设计论文
毕业论文
题目：
放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究
学院：
科学技术学院
专业：
植物保护
毕业论文任务书
论文题目
放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究
下发任务日期
2012年3月10日
学生姓名
Xxx
指导教师
xxxx教授
一.论文主要内容
通过对放线菌Snea253进行抗生素敏感性测定，得出各个菌株的最适浓度，从而对各菌株进行抗生素突变株的筛选，进一步测定突变株对线虫的活性。
对放线菌Snea253进行多次活化培养后，在在自然条件下筛选出外观和遗传稳定的菌株，共6株。
对所筛选出的6株菌及原始菌株在不同浓度梯度下进行抗生素敏感性试验。
所用抗生素分别为巴龙霉素、青霉素、氨苄霉素、链霉素、妥布霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿泊拉霉素、四环素、潮霉素、奇霉素。
二.论文的基本要求
1有关资料的收集及整理：
要求尽量收集第一手资料，资料要真实，要求条理清晰。
2查阅相关文献：
要求贴近课题，有参考价值，
3实验操作：
严格按照标准操作，遵守实验室的各项规定。
4结果分析：
要求条理清晰，数据分析详尽。
5认真撰写论文，字数在10000字以上。
三.论文工作进度安排
阶段
论文各阶段名称
日期
1
查阅相关文献，进行课题设计
2012.3-2012.6
2
查阅相关文献，进行试验准备
2012.7-2012.9
3
提取六株菌的DNA,并进行分析
2012.9-2012.12
4
做六株菌的敏感性试验
2013.3-2013.5
5
试验数据的处理，撰写论文
2013.5-2013.6
6
论文修改，准备答辩
2013.06
备注：
四.应收集的资料及主要参考文献（指导教师指定）
1.陈立杰,陈井生,段玉玺.2008.具毒杀植物线虫活力的链霉菌的制备方法及其应用[P].中国专利:
CN101225370B,2008-07-23．
3.陈立杰,陈井生,郑雅楠等.2009.放线菌Snea253的鉴定及对大豆胞囊线虫的抑制作用[J].中国生物防治,25
（1）:
66-69.
4.陈井生,陈立杰,段玉玺等.2010.放线菌Snea253代谢产物杀线虫谱研究[J].上海农业学报,26（3）:
80-82.
5.段玉玺,吴刚.2002.植物线虫病害防治[M].北京:
中国农业科学出版社.
6.段玉玺.植物线虫学[M].北京:
科学出版社,2011:
199.
7.刘维志.植物线虫植志[M].北京:
中国农业科学出版社.
沈阳农业大学毕业论文选题审批表
选题名称
放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究
题目来源
导师指导
学号
Xxxx
姓名
Xxxx
专业
植物保护
指导教师
Xxx
职称
教授
研究
内容
本试验主要对放线菌Snea253在抗生素不同浓度梯度下进行敏感性试验研究：
对自然条件下所筛选出的6株菌及原始菌株在不同浓度梯度下进行抗生素敏感性试验。
所用抗生素分别为巴龙霉素，青霉素，氨苄霉素，链霉素，妥布霉素，新霉素，庆大霉素，卡那霉素，阿泊拉霉素，四环素，潮霉素，奇霉素。
研究
计划
1．2012.3-2012.6查阅相关文献，进行课题设计
2．2012.7-2012.9查阅相关文献，进行试验准备
3．2012.9-2012.12提取6株菌的DNA,与原始菌株比较，并进行分析
4．2013.3-2013.5做6株菌和原始菌株的敏感性试验
5．2013.5-2013.6试验数据的处理，撰写论文
6．2013.6准备答辩
特色
指导教师意见
教研室意见
学院意见
毕业论文指导记录
学生姓名
Xxx
专业
植物保护
指导教师姓名
Xxxx
职称
教授
本年度指导毕业生人数
5
论文（设计）题目
放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究
指导过程
时间
地点
指导内容
2012.3..10
2012.3..20
2012.3..28
2012.4.03
2012.10.25
2013.5.09
2013.5.28
2013.6.15
2013.6.17
北方线虫研究所
北方线虫研究所
北方线虫研究所
沈阳农业大学线虫实验室温室大棚
北方线虫研究所
辽宁省康平县试验地
北方线虫研究所
北方线虫研究所
北方线虫研究所
确定论文（设计）题目
指导相关参考文献
检查试验设计方案
指导番茄种植
检查试验进度
指导试验作物春耕
检查论文初稿
检查论文终稿
组织预答辩
学生签字：
年月日
指导教师签字：
年月日
教研室主任签字：
年月日
沈阳农业大学毕业论文考核表
论文题目：
放线菌Snea253对抗生素敏感性的测定研究
姓名：
xxxx学号：
xxxx专业：
植物保护
指导教师评语：
指导教师（签字）：
年月日
评阅人评审意见：
评阅人（签字）：
年月日
答辩委员会意见：
成绩：
主任委员（签字）：
年月日
摘要
本文采用牛津杯法对链霉菌253菌株的1株原始菌株和6株自然突变株进行不同抗生素的敏感性试验。
通过本试验可以得出：
1.自然突变株Snea253-A对四环素、新霉素具有很高的耐药性，而对巴龙霉素、卡那霉素、阿伯拉霉素、庆大霉素敏感。
2.自然突变株Snea253-B对氨苄青霉素、四环素、新霉素具有很高的耐药性，而对巴龙霉素、阿伯拉霉素、链霉素、庆大霉素敏感。
3.自然突变株Snea253-F对四环素、新霉素具有很高的耐药性，而对巴龙霉素、阿伯拉霉素、链霉素、庆大霉素敏感。
4.自然突变株Snea253-G对氨苄青霉素、四环素、新霉素具有很高的耐药性，而对阿伯拉霉素、链霉素敏感。
5.自然突变株Snea253-H对氨苄青霉素、新霉素具有很高的耐药性，而对巴龙霉素、卡那霉素、阿伯拉霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素敏感；自然突变株Snea253-J对氨苄青霉素、四环素、新霉素具有很高的耐药性，而对巴龙霉素、卡那霉素、阿伯拉霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素敏感。
6.原始菌株Snea253-CK对氨苄青霉素、青霉素、四环素、新霉素具有很高的耐药性，而对巴龙霉素、卡那霉素、阿伯拉霉素、链霉素、妥布霉素敏感。
由此结论可知，自然突变后的各菌株与原始菌株Snea253-CK相比较，不仅在形态上发生了明显的变化，在对抗生素敏感性方面也发生了明显的改变。
关键词：
放线菌Snea253；抗生素；敏感性；耐药性
Abstract
SensitivitytestofSnea253andits6naturemutantstrainstodifferentantibioticswereconductedbyOxfordcupmethod.Thetestresultsareasfollows:
1.NaturemutantstrainSnea253-Ahadhighresistancetotetracyclineandneomycinwhilesensitivetoparomomycin,kanamycin,doxycycline,gentamicin.
2.NaturemutantstrainSnea253-Bhadhighresistancetoampicillin,tetracyclineandneomycinwhilesensitivetoparomomycin,arbor,streptomycin,gentamicin.
3.NaturemutantstrainSnea253-Fhadhighresistancetotetracyclineandneomycinwhilesensitivetoparomomycin,arbor,streptomycin,gentamicin.
4.NaturemutantstrainSnea253-Ghadhighresistancetoampicillin,tetracyclineandneomycinwhilesensitivetoarborandstreptomycin.
5.NaturemutantstrainSnea253-Hhadhighresistancetoampicillinandneomycinwhilesensitivetoparomomycin,kanamycin,arbor,streptomycin,gentamicinandtobramycin.
6.NaturemutantstrainSnea253-Jhadhighresistancetoampicillin,tetracyclineandneomycinwhilesensitivetoparomomycin,kanamycin,arbor,streptomycin,gentamicinandtobramycin.
7.OriginalstrainSnea253-CKhadhighresistancetoampicillin,penicillin,tetracyclineandneomycinwhilesensitivetoparomomycin,kanamycin,doxycycline,gentamicin,paromomycin,kanamycin,arbor,streptomycinandtobramycin.
Theconclusionshowsnaturemutantstrainshadobviouschangeinbothmorphologyandantibioticssensitivity,comparedtooriginalstrainSnea253-CK.
Keywords:
ActinomycetesSnea253;Antibiotics;Sensitivity;Drugresistance
前言
植物寄生线虫具有分布广、寄主多、危害严重等特点，是植物病害的主要病原之一。
全世界已经报道的植物寄生线虫多达200多个属5000多种，其危害程度远远超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。
据估计，线虫的危害每年在全球造成的经济损失高达800～1000亿美元，约占总农业损失的10%（段玉玺,2002）。
在实际的农业生产中，人们大多选择化学药剂的防治方法，大量化学杀线剂的使用对植物、人畜和环境等造成了的危害和污染，因此，社会对化学农药的约束和限制也越来越多；现代农业迫切需求高效、低毒、低残留的杀线剂来替代已被限制的高毒化学杀线剂，因此研究和开发安全性高的天然源农药已成为当今新型杀（线）虫剂研究的热点，尤其是微生物源的杀虫（线虫）抗生素的开发近20年内已取得飞速的发展。
委内瑞拉链霉菌（S.venezuelae）是研发较早的医用抗生素来源菌之一。
Uchida（1975）从委内瑞拉链霉菌Tü1102中分离出核酸霉素（Rinamycin），它能抑制真菌、酵母菌、革兰氏阳性和一些阴性细菌。
其产生的双氢苦霉素（Dihydropicromycin）可抑制枯草杆菌及其耐红霉素菌株（Majer,1976）。
委内瑞拉链霉菌还能产生大环内酯类抗生素如酒霉素（Methymycin）、新酒霉素（Neomethymycin）和苦霉素（Picromycin）（Graziani，1998）。
苟丽霞（2010）研究发现委内瑞拉链霉菌RL-2活性产物强烈抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发，引起菌丝膨大和畸形、孢子萌发率降低、萌发孢子芽管畸形。
2008年沈阳农业大学北方线虫研究所从吉林省辽源市土壤中分离筛选到一株具有杀线虫活性的放线菌菌株Snea253，该菌株的代谢产物能抑制大豆胞囊线虫（Heteroderaglycines）卵的孵化，并且对大豆胞囊线虫的二龄幼虫J2具有毒杀作用。
通过形态学特征、生理生化特征及16SrDNA分析，初步鉴定该菌株为委内瑞拉链霉菌（Streptomycesvenezuelae）（陈立杰,2009），菌株及其制备方法已获得国家发明专利授（ZL200810010465.X）（陈立杰,2008）。
陈井升（2010）采用稀释分离法室内测定了链霉菌Snea253的代谢产物对南方根结线虫（M.incognita）、北方根结线虫（M.hapla）、水稻干尖线虫（Aphelenchoidesbesseyi）和小杆线虫（Caenarhabditissp.）的毒力作用，研究结果表明链霉菌Snea253的代谢物对不同种类线虫存在选择性毒力差异，其代谢物对南方根结线虫和北方根结线虫表现出较高的生物活性，对水稻干尖线虫毒力较弱，对小杆线虫的毒力最弱，而且随着稀释倍数的增加毒力减弱。
目前，基因工程育种和新型抗生素研究中最有效的一个手段，就是利用抗生素耐药性突变进行工程菌种的改良以及无活性菌株的诱导激活。
这项技术最早由日本越智幸三教授带领的研究小组提出（Shimaetal,1996），其原理是利用能够作用于核糖体的某些抗生素（如链霉素、庆大霉素等），从而改变微生物核糖体的结构和功能，影响其次生代谢产物（HeskethandOchi,1997;Ochietal,2004）。
这项技术目前已经在许多工程菌种的改良上获得了成功（HuandOchi,2001;Tamehiroetal,2003），而且在无活性菌株的诱导激活方面也取得了重大成果。
Shima等（Shimaetal,1996）对不产生放线紫红素Act的变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）进行链霉素抗性诱导，得到的突变株TK224能够合成大量的放线紫红素Act。
路福平等（1997）利用四环素等抗生素的抗性突变，使一株拟诺卡氏放线菌产生了抗真菌活性。
于志斌等（2006）利用链霉素诱导激活1株无活性放线菌产生了抑制肿瘤细胞的新物质—bis（2S-ethylhexyl）maleate。
1材料与方法
1.1菌株来源
放线菌Streptomyces菌株Snea253由沈阳农业大学北方线虫研究所提供。
1.2线虫
南方根结线虫（Meloidogyneincognita）在温室中用盆栽番茄繁殖南方根结线虫（番茄品种为L402）。
1.3培养基及灭菌
1.3.1培养基
高氏一号培养基（可溶性淀粉20g；NaCl0.5g；KNO31g；K2HPO40.5g；MgSO4·7H2O0.5g；FeSO40.01g；琼脂15-20g；pH7.2-7.4；水1000mL）
种子培养基（可溶性淀粉24g；牛肉膏3g；蛋白胨3g；酵母粉5g；葡萄糖1g；CaCO34g；蒸馏水1000mL；pH7.2）
高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g；NaCl0.5g；KNO31g；K2HPO40.5g；MgSO4·7H2O0.5g；FeSO40.01g；黄豆粉40g；pH7.2-7.4；水1000mL）
1.3.2培养基的灭菌
采培养基多以高压灭菌，指标是121℃、30min。
集体操作方法如下：
①加入待灭菌的培养基，密闭锅盖，打开气门，加热，至灭菌器内冷空气完全排除后，关闭气门。
②当压力升到所需指标，开始计时，并保持灭菌压力恒定。
③达到灭菌时间，停止加热，微开气门，缓慢排气，使压力渐渐下降。
④使压力恢复至零点（内外压力相等）时，打开锅盖，取出培养基。
1.4孢子悬浮液的制备
将无菌室喷水打扫清洁。
打开操作台紫外灯，在操作室内喷洒少量酒精。
对操作台预热消毒30min。
点燃酒精灯，对移植钩加热消毒。
挑取平板培养的孢子及菌丝接种于盛有高氏液体培养基的三角瓶中，29℃，120RPM振荡培养7d，用灭菌的脱脂棉过滤除去菌丝，即得109/mL的孢子悬浮液。
1.5抗生素的配制
以链霉素为例，其它11种抗生素配制方法相同。
1.5.1母液的配制
用分析天平称取链霉素0.010g溶于10ml的无菌水中，涡旋振荡1min使其充分溶解，保存在-4℃的冰箱中备用。
1.5.2各浓度梯度抗生素的配制
用量程为100-1000ml的移液枪准确吸取400ul的链霉素母液，将其溶于1600ul的无菌水中，涡旋振荡1min使其充分溶解，得到2ml浓度为200ug/ml所需的链霉素溶液，以此方法依次配制150ug/ml，120ug/ml，90ug/ml，70ug/ml，50ug/ml，30ug/ml，10ug/ml等浓度的所需链霉素溶液。
1.6试验器材
牛津杯内径（6.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；培养皿（内径90mm，高16mm）；尼康单反相机，型号：
NikonD90；生化培养箱（上海一恒）；分析天平；移液枪（Thermo）；无菌操作台（苏净安泰）型号：
SW-CJ-2FD。
1.7链霉菌的敏感性试验
1.7.1检测平板的制备
将高氏培养基，在高压灭菌锅中，121℃灭菌30min，并冷却至45℃左右，将之前做好的孢子悬浮液1ml加入到200ml的培养基中，轻轻摇动混匀，用吸管准确量取25mL该培养基，加入内径一致并预先水平放置的培养皿内，凝固后并使培养皿中水分充分干燥，用该平板进行抑菌试验。
1.7.2牛津杯的放置
将镊子在酒精中浸泡，并过火灼烧致镊子发红，重复三次；然后用过火后的镊子将在121℃灭菌30min的牛津杯轻轻放入所得的检测平板上，并等距离放置。
1.7.3抗生素的加入
用量程为10-100ul的移液枪准确吸取50µl一定浓度的抗生素加入到放置好的牛津杯中，注意不要将抗生素溢出牛津杯外。
将培养皿置于28℃培养箱中放置培养48h后，测量抑菌圈的大小。
2结果与分析
利用十字交叉取平均值法测各浓度梯度下抑菌圈直径的大小，对所测结果用DPS进行分析。
2.1放线菌Snea253对抗生素各浓度的敏感性差异
2.1.1浓度为200µg/mL敏感性差异分析结果
所测得的6株自然突变株（分别命名为Snea253-A、Snea253-B、Snea253-F、Snea253-G、Snea253-H、Snea253-J）及原始菌株（命名为Snea253-CK）在12种抗生素（分别为巴龙霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、奇霉素、潮霉素、阿伯拉霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、四环素、新霉素）的作用下产生的抑菌圈直径的大小进行分析。
所得的敏感性差异结果见表1中数据所示（5%显著水平）。
表1六株自发突变株菌及CK对浓度为200µg/ml的12种抗生素的敏感性差异分析结果
抗生素
Snea253-菌株
A
B
F
G
H
J
CK
巴龙霉素
25.58d
24.09ab
22.34cd
28.73b
2.457c
24.19c
23.91bc
卡那霉素
27.86cd
23.96b
25.01b
21.88c
2.512c
24.71bc
26.26b
氨苄青霉素
12.41f
0e
11.79e
0g
0f
0f
0f
奇霉素
15.49f
13.21d
10.22e
10.41e
18.93d
16.37d
14.59e
潮霉素
21.17e
20.81c
21.52d
17.65e
19.72d
15.12de
16.16d
阿伯拉霉素
35.36a
24.93a
26.93a
29.78a
32.49a
28.46b
32.26a
青霉素
13.49f
11.61d
11.38e
17.20e
12.76e
13.06e
0f
链霉素
30.88ab
2.691a
24.71ab
27.95b
28.03b
30.61a
30.94a
庆大霉素
26.43cd
23.95ab
23.88bc
20.04d
23.82c
23.38c
26.33b
妥布霉素
30.77bc
23.14b
24.17bc
28.13b
26.55b
23.12c
23.96c
四环素
0g
0e
0f
0g
12.63e
0f
0f
新霉素
0g
0e
0f
0g
0f
0f
0f
由表1可知，在12种抗生素浓度均为200µg/ml时，自然突变株Snea253-A在阿伯拉霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在四环素、新霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-B在链霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在氨苄青霉素、四环素、新霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-F在阿伯拉霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在四环素、新霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-G在阿伯拉霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在氨苄青霉素、四环素、新霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-H在阿伯拉霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在氨苄青霉素、新霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-J在链霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在氨苄青霉素、四环素、新霉素作用下未产生抑菌圈；原始菌株Snea253-CK在阿伯拉霉素作用下产生的抑菌圈最大，而在氨苄青霉素、青霉素、四环素、新霉素作用下未产生抑菌圈。
2.1.2浓度为150µg/mL敏感性差异分析结果
所测得的6株自然突变株及原始菌株在12种抗生素（分别为巴龙霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、奇霉素、潮霉素、阿伯拉霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、四环素、新霉素）的作用下产生的抑菌圈直径的大小进行分析。
所得的敏感性差异结果见表2中数据所示（5%显著水平）。
与表1比较可知，在各个抗生素浓度为150µg/ml时，表2中新出现了：
自然突变株Snea253-F在青霉素、氨苄青霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-G在奇霉素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-H在四环素作用下未产生抑菌圈；自然突变株Snea253-J在奇霉素作用下未产生抑菌圈。
表2自发突变株对浓度为150µg/ml的12种抗生素的敏感性差异分析
抗生素
Snea253-菌株突变株菌落直径（mm）
A
B
F
G
H
J
CK原始菌株
巴龙霉素
26.03c
21.68c
21.19cd
25.06b
24.71bc
22.92c
22.18d
卡那霉素
25.09c
21.89bc
24.24b
22.93c
24.72bc
25.61b
25.67c
氨苄青霉素
12.21f
0f
0f
0f
0f
0f
0g
奇霉素
13.81e
10.92e
13.15e
0f
17.25d
0f
12.08f
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