中图版选修一 测定微生物的数量 学案.docx

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中图版选修一测定微生物的数量学案

第三节

测定微生物的数量

一、测定微生物数量的方法

测定微生物数量的方法可分为两类：

直接计数法和间接计数法。

前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。

该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。

后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。

利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？

【提示】　血球计数板测出的是全部菌体数，而平板计数法只能测出活菌数，而且比实际数偏少。

二、间接计数法的实验设计

1．制备土壤稀释液

取土壤表层5～10cm处的土样。

准确称取1g土样，放入盛有99mL无菌水的锥形瓶中，振荡20min后制成102倍的稀释液。

然后进行系列稀释，得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。

2．取样及倒平板

3．培养

4．观察记录

（1）计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30～300个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10～100个菌落为宜。

（2）计算每克样品菌数公式为：

每克土壤样品菌数＝

×稀释倍数。

预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中

问题1

问题2

问题3

问题4

一、微生物生长量的测定

1.测重量法

干重法：

将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤1～5次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100～105℃之间，再称重。

以细菌为例，一个细胞一般重约10－12～10－13g，也可在较低温度（如40℃）下进行真空干燥。

湿重法：

将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的20%～25%。

2．计数法

（1）直接计数法

这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

此法的缺点是不能区分死菌与活菌。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成。

将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。

每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×1000×稀释倍数

（2）间接计数法（活菌计数法）

稀释平板涂布法，常用来统计样品中的活菌数。

此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。

计数时先将待测样品做一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿上，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

说明：

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。

②将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放入适宜的温度下培养计算菌落数。

为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布、培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

④涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。

二、测定土壤中的微生物数量

土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的，这些数量众多的微生物对提高土壤肥力有重要作用。

因此，测定土壤的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。

1．实验原理

平板菌落计数法是将待测定的微生物样品按比例作一系列稀释后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，吸取一定量某几个稀释度的菌液接种到平板上，培养一段时间后，每个单细胞生长繁殖形成单个菌落，根据稀释倍数、取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。

2．材料用具

土壤样品：

尿素，酵母粉，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠、酚红、琼脂，1mol/LNaOH溶液，无菌吸管，盛有9mL无菌水的试管，盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶，试管架，无菌培养皿，记号笔，烧杯等。

3．方法步骤

（1）制备尿素固体培养基

准确称取尿素20g，酵母粉0.1g，磷酸二氢钾9.1g，磷酸氢二钠9.5g，酚红0.01g，琼脂20g，依次加入盛有900mL蒸馏水的烧杯中，加热溶解后，用1mol/LNaOH溶液调pH至7.2～7.4，补加蒸馏水至1000mL。

（2）制备土壤样品稀释液

称取土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振荡约20min，使土样和水充分混合，将土壤悬液制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6不同稀释度的稀释液。

制备土壤样品稀释液时应注意每个吸管只能接触一个浓度的稀释液，且取样前需充分摇匀。

（3）加样

取10套无菌培养皿，取10－4、10－5和10－6每种稀释度做3个重复平板，留下一个平板作空白对照。

分别用1mL无菌移液管精确吸取10－4、10－5、10－6三个稀释度菌悬液各0.2mL，加至相应编号的无菌培养皿中（如图）。

微生物数量测定的流程图

（4）倒平板

将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至45℃左右的尿素培养基（倒入量约15mL），随即快速晃动培养皿，使菌液和培养基充分混匀后平置，待凝。

（5）培养

待平板完全凝固后，倒置于恒温箱中37℃培养。

（6）统计菌落数

培养48h后取出平板，统计各皿中的菌落数，将结果记录在表格中，计算结果时，应选取每皿菌落数在30～300（如图）的一组平板为代表进行统计。

每皿菌落数示意图

（7）计算样品中菌数的公式

每克样品的菌数＝同一稀释度的菌落平均数÷0.2÷稀释度×10

直接计数法统计菌数

　在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。

计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。

计数室由25×16＝400个小室组成，容纳液体总体积为0.1mm3。

某同学操作时将1mL酵母菌样品加99mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。

（1）在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：

①从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；②把酵母菌培养液放置在冰箱中；③第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。

请纠正该同学实验操作中的3处错误：

①______________________________________________________________。

②______________________________________________________________。

③______________________________________________________________。

（2）在实验前应该对计数板、吸管等器具进行______处理。

（3）如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是____________。

（4）如果观察到如图所示a、b、c、d、e5个大格共80个小室内共有酵母菌48个，则上述1mL酵母菌样品中约有酵母菌________个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？

__________________。

【解析】　对各小题逐项分析如下

题号

分析

（1）

在从试管中吸取酵母菌之前，应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培养液中均匀分布。

酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔24小时就要统计一次菌落数目

（2）

为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理

（3）

（4）

解答时要注意以下两点：

①统一单位；②注意体积的变化。

400个小室共容纳液体总体积为0.1mm3，则80个小格容纳体积为：

2×10－2mm3，含酵母菌48个，又因酵母菌培养液总体积为100mL，统一单位后即可求出酵母菌个数

【答案】　

（1）①应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数

②应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养

③应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据

（2）灭菌　（3）适当稀释

（4）2.4×108　多次计数，求平均值

1．上题中某同学用一支移液管连续三次取1mL菌液进行稀释，（过程如图）中间忘记冲洗移液管，计数结果将（　　）

A．偏低　　　　　B．偏高

C．不变D．无法判断

【解析】　由于移液管未冲洗，下一次使用时会带有上次的高浓度菌液，使计数结果偏高。

【答案】　B

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

　（2016·四川高考）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

（1）图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。

（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。

该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。

突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。

【审题导析】

【精讲精析】　

（1）脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。

挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。

（2）该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。

利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为（156＋178＋191）÷3＝175个。

每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108。

血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞（只有活细胞才能在平板上生长），故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。

（3）箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。

从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。

【答案】　

（1）尿素　酚红　红　

（2）稀释涂布平板法　1.75　少　（3）UGA　115

稀释平板计数法的误差分析

（1）稀释时移液管不冲洗，偏大；

（2）平板中菌落数太多，（可能重复）偏小；

（3）稀释时未混合均匀，可能大可能小。

2．在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除含尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作、培养与观察，则乙组实验属于（　　）

A．空白对照　　　　　B．标准对照

C．相互对照D．条件对照

【解析】　本实验甲组为实验组，乙组为对照组，给实验组某种处理，给对照组另一条件的处理，为条件对照。

【答案】　D

1．噬菌斑（如图1）是在长满细菌的培养基上，由一个噬菌体侵染细菌后不断裂解细菌产生的一个不长细菌的透明小圆区，它是检测噬菌体数量的重要方法之一。

现利用培养基培养并连续取样的方法，得到噬菌体在感染大肠杆菌后数量的变化曲线（如图2），对该曲线的叙述正确的是（　　）

A．曲线a～b段噬菌体数量不变，说明噬菌体还没有开始侵染细菌

B．曲线a～b段，细菌内正旺盛地进行细菌DNA的复制和有关蛋白质的合成

C．曲线b～c段所对应的时间内噬菌体共繁殖了10代

D．限制c～d段噬菌斑数量增加的因素最可能是绝大部分细菌已经被裂解

【解析】　图中a～b段噬菌斑已有一定数量，说明噬菌体已开始侵染细菌。

b～c段噬菌斑增加了10倍，说明噬菌体数约增加了10倍，而噬菌体繁殖10代，噬菌体数目应增加到210倍。

c～d段噬菌斑数目增加减缓，很可能由于绝大多数宿主细菌细胞已被裂解。

【答案】　D

2．菌种鉴定的重要依据是（　　）

A．细菌的大小、形状和颜色

B．菌落的大小、形状、颜色

C．有无鞭毛

D．培养基的不同

【解析】　不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为鉴定的重要依据。

单个细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作为菌种鉴定的依据。

【答案】　B

3．请选出进行土壤中细菌计数的正确的操作步骤（　　）

①土壤取样　②称取1g土壤放入盛有99mL无菌水的锥形瓶中　③吸取0.5mL进行平板涂布　④依次稀释至102、103、104、105、106倍稀释度

A．①→②→③→④　B．①→③→②→④

C．①→②→④→③D．①→④→②→③

【解析】　在分离土壤中某细菌时，应先选取土样（1g），然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。

【答案】　C

学业达标测评（三）

一、选择题

1．下列不属于统计菌数方法的是（　　）

A．显微镜直接计数法

B．活菌计数法

C．稀释平板计数法

D．标志重捕法

【解析】　标志重捕法是统计动物种群密度的方法。

【答案】　D

2．测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是（　　）

A．细菌个体小，真菌个体大

B．细菌易稀释，真菌不易稀释

C．细菌在土壤中含量比真菌高

D．随机的，没有原因

【解析】　稀释的目的是使平板培养基上菌落数适中，便于计数。

细菌在土壤中含量比真菌高，故稀释倍数高。

【答案】　C

3．某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（　　）

A．2.34×108　　　　　B．2.34×109

C．234D．23.4

【解析】　平板上菌落的平均数×稀释倍数＝每毫升样品中的菌落数，即234×10×106＝2.34×109个。

【答案】　B

4．下列关于“检测土壤中细菌总数”的实验操作的叙述中，不正确的是

（　　）

A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，高温、高压灭菌后倒平板

B．取稀释倍数为104、105、106的土壤稀释液和无菌水各0.1mL涂布于不同的平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300个以上的平板进行计数

【解析】　本题以“检测土壤中细菌总数”实验为命题点。

检测土壤中细菌总数时，要先用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，然后取稀释倍数为104、105、106的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时，最后在确定对照组无菌后，为保证实验结果的准确性，应选择菌落数在30～300个的平板进行计数。

【答案】　D

5．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（　　）

A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水

B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水

C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水

D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水

【解析】　分解尿素的细菌除了加入尿素作为氮源外，还需要葡萄糖作为碳源和能源。

【答案】　A

6．在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。

A同学的结果产生原因可能有

（　　）

①由于土样不同　②由于培养基污染　③由于操作失误　④没有设置对照实验

A．①②③B．②③④

C．①③④D．①②④

【解析】　导致A同学菌落数目过高的原因既可能是取样问题，也有可能是培养基被其他微生物污染，还有可能是实验操作出现失误。

与设置对照实验与否无关。

【答案】　A

7．下列叙述错误的是（　　）

A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离

B．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同

C．只有得到了3个或3个以上菌落数目在30～300之间的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数

D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落

【解析】　如果涂布三个平板能够得到2个菌落数目在30～300之间的平板，就说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

计数的方法是舍弃相差很大的一个，然后取平均值。

【答案】　C

8．某细菌培养至对数期，当细菌数目为105个/mL时，开始计时，90min后细菌数目为1.6×106个/mL。

试问再经过多久，细菌数目会达到6.4×106个/mL（　　）

A．30minB．45min

C．60minD．90min

【解析】　按公式Nt＝N0×2t，则1.6×106＝105×2t,2t＝16，t＝4。

即细菌由105个/mL→1.6×106个/mL，共繁殖了4代，每个繁殖周期为

＝22.5min。

仍按此公式可知，由1.6×106个/mL→6.4×106个/mL，繁殖了2代，共需2×22.5＝45min。

【答案】　B

二、非选择题

9．自然界中的微生物往往是混杂生长的。

人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。

下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

（1）步骤如下：

①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

②若对大肠杆菌进行计数，应选用________________法接种样品。

③适宜温度下培养。

（2）结果分析

①测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是________。

A．一个平板，统计的菌落数是23

B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24

C．三个平板，统计的菌落数分别是31、9和32，取平均值24

D．四个平板，统计的菌落数分别是31、32、34和35，取平均值33

②一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是（涂布平板时所用的稀释液体积为0.2mL）________。

③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________（填“多”或“少”），因为___________________________。

【解析】　

（1）②若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释平板涂布法接种样品。

（2）①应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。

②23.4÷0.2×106＝1.17×108。

③因为菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

【答案】　

（1）②稀释平板涂布　

（2）①D　②1.17×108

③多　当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落

10．在现代农业中，常在饲料中加入一定量的尿素去饲养牛等牲畜，因这类牲畜具有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素为唯一氮源。

某同学设计了如下实验，对能分解尿素的细菌进行分离和计数。

①取样：

到屠宰场从刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装入事先准备好的信封中密封。

②制备培养基：

制备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。

由于初次实验，选择了一个较宽的稀释范围，并且每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。

③微生物的培养与观察：

按稀释度的顺序分别吸取0.1mL菌液进行平板涂布操作。

将涂布好的培养皿放在30℃下培养，并且需要无氧条件。

比较两种培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基中，观察是否发生颜色反应。

④细菌的计数：

当菌落数目稳定时，选取平板计数。

请回答下列问题：

（1）制备牛肉膏蛋白胨培养基的目的是____________________________。

（2）每个稀释度下需要3个选择培养基，原因是_______________。

（3）上述培养需要无氧条件，请解释原因________________________。

（4）应用含酚红指示剂的培养基的目的是________，结果会呈现________色，原理是_________________________________。

（5）计数时应选________的平板进行计数，写出计算样品中细菌数目的方法

______________________________________________________________。

【解析】

（1）制备牛肉膏蛋白胨培养基的目的是为了比较其中的菌落数目和选择培养基的菌落数目，看选择培养基是否起到了选择作用。

（2）设立3个培养基的目的是作为重复组，取平均值，以减小误差。

（3）牛的瘤胃是一个无氧环境，生活在其中的微生物多为厌氧菌，所以设计实验时要创造无氧环境。

（4）分解尿素的细菌在脲酶的作用下反应：

CO（NH2）2＋H2O

CO2＋2NH3，其产物中的NH3可使培养基碱性增强，pH升高，使酚红指示剂呈现红色。

（5）选择菌落数在30～300个的平板计数，结果会最准确。

【答案】　

（1）作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用

（2）涂布3个平板作为重复组，以增强实验结果的说服力与准确性

（3）瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气会死亡

（4）作为鉴别培养基，看是否有分解尿素的细菌存在　红　分解尿素的细菌产生脲酶，催化尿素分解并产生NH3，使培养基的pH升高，酚红指示剂呈红色

（5）菌落数在30～300个　根据平板所对应的稀释度，对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，以此估算样品中细菌的数目