电泳常见问题解答.docx

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电泳常见问题解答

1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

2.样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：

还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：

在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。

一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：

碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。

100ul样品缓冲液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：

生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：

浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：

AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：

阳离子去污剂，作用有四：

去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4.提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

建议做法：

待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。

忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。

一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：

待其充分凝固再作后续实验。

6.“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：

可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7.为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：

加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

8.为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：

加样前离心；加适量样品促溶剂。

9.什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。

但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：

在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙

醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。

主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：

更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

11.为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：

适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

12.为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。

比如电压50v以上，可电流却在

5mA以下。

主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。

包括：

a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：

电泳槽正确装配即可。

13.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。

前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14.凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。

如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。

APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。

如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15.电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

我们实验室的传统也是将倒完的胶放在冰箱内过夜凝聚，第二天跑胶效果非常好。

我想主要原因并不在于低温，而在于过夜时间长，让胶凝聚得非常充分而且均匀。

反之，在37温箱内虽然凝得很快，但是容易出现胶脆，凝聚不均匀等情况。

我想只要你得配液没问题，那么适当延长凝胶时间肯定效果会好些！

温度的高低决定了胶聚合的速度：

高温有助于胶的聚合。

但是，胶聚合得越快，其脆性也越大。

因此，一般把胶的聚合时间控制在40-60分钟左右为宜。

当然，灌胶后放入4度聚合，其聚合时间会大大延长，但是其脆性也会大大降低上层的浓缩胶用的是Tris-HCL缓冲液，PH6.8，HCL的解离度大，几乎全部成CL-，CL-在电场中移动最快。

而电泳槽中含有甘氨酸，在PH6.8时只有少量解离，在电场中移动的最慢。

蛋白质（被夹在中间）就在由快慢离子形成的电位梯度中被浓缩了。

下层的分离胶用的是Tris-甘氨酸缓冲液，PH8.8，在此PH下，甘氨酸解离度增大，

泳动速度增加并超过了蛋白质，原先的电位梯度消失，大小形状不同的蛋白质在电场中分离。

电泳结果的好坏肯定和电泳的条件有关,我认为应该注意以下几点:

1,样品的纯度高,杂质含量少,选择的Loading要正确;

2,就是胶的浓度要控制好,看你跑的条带大小来选择胶的浓度,特别是分离胶的浓度!

3,就是电压的选择,当样品在浓缩胶里时,可以把电压调小点,当到分离胶时,电压可以加大,这样跑的条带就清晰!

4,点样品的量要控制好,不能太多,否则就跑成团状,也不能太少,条带不清晰!

至于样品和Marker显色问题,那要看你用的Marker是预染Marker还是非预染Marker,如果用的是预染Marker,那就是跑胶时,Marker条带先显现出来!

如果是非预染Marker,那条带就和样品一起染色时显现出来!

SDS-PAGE经验集锦：

极其好用2009-06-2800:

17蛋白SDS-PAGE电泳及定量在蛋白质技术手册[5]基础上，根据实验条件的方便修改。

请仔细看各种细节改良，各种操作效果经本实验室5年验证。

【一】储存液配制（注意配方和实际测定参数！

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）

（1）2MTris-HCl（实测pH8.9±0.1，25℃）500mL：

121gTrisbase加350mL双蒸水溶解，以玻璃棒搅拌约1min，缓慢加入浓盐酸（11.8M）20mL，继续搅拌均匀，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入适量双蒸水至500mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。

（2）100g/LSDS溶液：

10gSDS（要求高纯度，其质量明显影响电泳效果）加100mL双蒸水，于洁净的250mL烧杯中进行微波加热溶解，注意不要爆沸，间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解，完全溶解后的溶液应清澈透明无色。

倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。

冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化。

（3）75%（v/v）甘油：

于500mL量筒中倒入分析纯甘油300mL，加双蒸水100mL，以一次性塑料手套封口，颠倒量筒使甘油完全溶解，然后倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。

（4）10g/L溴酚蓝溶液：

500mg溴酚蓝加双蒸水50mL，搅拌溶解，倒入棕色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。

不用过滤。

用时注意吸取上层澄清液，不要吸到沉淀。

【二】电泳工作液配制（省劲好用！

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）

（1）Acr-Bis液（丙烯酰胺溶液）500mL：

于800mL洁净的烧杯中，依次称取双丙烯酰胺4g，丙烯酰胺146g，缓慢倒入双蒸水约350mL，以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。

注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中，所以要称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖。

玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。

完全溶解的溶液应清澈无色透明。

待溶解完全后补加双蒸水至500mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱可保存10个月。

2）4×分离胶缓冲液，500mL：

于500mL洁净的量筒中，依次加入375mL2MTris-HCl（实测pH8.9±0.1，25℃），100g/LSDS溶液（冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化）20mL，最后加入适量双蒸水至500mL。

倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存12个月。

有时冰箱温度过低会使储存液混浊，微波略微加热使其澄清后即可使用。

（3）100g/L过硫酸铵溶液（ammoniumpersulfate,AP）20mL：

2g过硫酸铵加20mL双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存10个月。

注意配胶时不要交叉污染TEMED，可以以5mL分装到4个无色塑料试剂瓶中分别保存。

（4）TEMED成品液：

购买后分装成2或5mL小管装使用可避免母液受到污染。

（5）5×样品缓冲液，100mL：

依次加入50mL75%（v/v）甘油，20mL100g/LSDS溶液，10mL10g/L溴酚蓝溶液，5mL2MTris-HCl（实测pH8.9±0.1，25℃），5mL巯基乙醇，9mL双蒸水。

混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱至少可保存12个月。

可分装成10mL使用，不会使母液受到蛋白污染。

（6）10×电泳缓冲液，1000mL：

称取10gSDS，30gTrisbase，144g甘氨酸（事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色的产品）于1000mL的烧杯中，加水约700mL溶解，可微波炉加热（＜80℃）以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可，间歇用玻璃棒搅拌。

分装至无色玻璃试剂瓶中，室温最少可保存6个月。

其pH值约为pH8.4±0.1。

【注意可省去pH6.8的浓缩胶缓冲液，用4×分离胶缓冲液pH8.9的

替代即可】

【三】12%电泳胶的配制要注意的是，配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以枪头搅拌约10-20sec，灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的水层（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于37℃凝固15-30min。

而在配胶时浓缩胶只加前三个组分，混合液要于4℃冰箱保存，待分离胶凝固后再取出加入AP和TEMED溶液，枪头搅

拌均匀，灌胶后插入梳子，然后于37℃凝固15-30min。

凝固的胶连

μL

TEMED

其他浓度的电泳胶配制

A%电泳胶的配制（10mL）

TableA%Gelcomponents（10mL）

Reagents

Seperatinggel

Condensinggel

二块

30%Acr-Bissolution[（A%*10mL）

0.67mL

4×seperatinggelbuffer2.5

1mLpH8.9

H2O

2.3mL

100g/LAP

30μL

TEMED

5μL

/30%]mL

mLpH8.9

补足10mL

50μL

其中的H2O补足10mL，所用的计算公式为：

10mL-2.5mL-[（A%*10mL）/30%]mL。

例如6%的配方中，

30%Acr-Bissolution2mL

H2O5.5mL

例如12.5%的配方中，

例如15%的配方中，

2.5mL

【四】考马斯亮蓝染色和脱色（极其好用！

！

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）

考马斯亮蓝染色液1000mL：

先称取考马斯亮蓝R2501.0g于1000mL试剂瓶内，加入甲醇450mL溶解，再加冰醋酸100mL和双蒸水450mL至大约1000mL。

室温可放置12个月以上。

染色液可倒入专用的回收试剂瓶，届时加入适量甲醇、考马斯亮蓝和大约10g/L的三氯乙酸后可重复使用。

考马斯亮蓝脱色液10L：

于10L洁净塑料桶内装入工业乙醇2L，冰醋酸500mL，加入去离子水至10L，混匀，室温可放置12个月以上。

蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色：

凝胶的染色和脱色于合适体积的微波炉盒中进行。

电泳后的凝胶加入染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约40-70sec至染色液刚刚沸腾（注意塑料盒的盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸出），然后于脱色摇床上继续染色约10min即可。

染色液请倒入专用的回收容器内。

以自来水小心地淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色液，微波加热至刚沸腾后于染色摇床上摇动约10min，倒掉脱色液，此时凝胶的蛋白条带即可看清。

重复以上脱色步骤一次，即可看清电泳条带。

扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色，这需要重新换上脱色液室温摇床脱色2h以上。

【五】蛋白上样量的选择

要根据具体情况决定，对于考马斯亮蓝染色，如果样品为菌体蛋白样品，有至少50条以上的条带要显出来，需要上样量在15μg左右即可，如果蛋白条带少于6条，如蛋白Marker或纯化阶段后期的蛋白样品，上样量可减少至2μg即可显出清晰的条带。

【简化成大肠杆菌上样，大约等于5.0个OD600上样10-15uL左右】【本内容由华东理工大学鲁华生物技术研究所提供，尊重作者劳动成果，转帖请注明】