新编生物化学实验讲义.docx
《新编生物化学实验讲义.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新编生物化学实验讲义.docx（43页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
新编生物化学实验讲义
新编生物化学实验讲义
谢宁昌刘洋王桂兰
班级学号姓名
页码
生化实验安排
2
实验一.粗脂肪的定量测定---索氏（SOXhlet）提取法
3
实验二.氨基酸的分离鉴定---纸层析法
5
实验三.血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
7
实验四.蛋白质的定量测定---微量克氏（Kjeldahl）定氮法
8
实验五.紫外吸收法测定核酸的含量
12
实验六.酶活力测定
14
实验七.血糖的定量测定---Hagedorn-Juensen定糖法
17
实验八.米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定
19
实验九.酶促反应进程曲线的制作和初速度的测定
23
生化实验室开放规则
实验计划
专业
学时数
人数
应做实验
地点：
实验大楼404实验室
生物工程
40
190
1-9
制药工程
20
136
1、3、5、6、7
药物制剂
30
106
1、2、3、5、6、7、8
实验内容和管理实验员
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
实验
名称
粗脂肪的定量测定-索氏提取法
氨基酸的分离鉴定-纸层析法
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
蛋白质的定量测定-微量克氏定氮法
紫外吸收法测定核酸的含量
酶的活力测定
血糖的定量测定
米氏方程的确定
酶促反应进程曲线的制作和初速度的测定
耗时（hr）
4
6
4
6
4
4
4
4
4
专业
生工
药剂
制药
生工
药剂
生工
药剂
制药
生工
生工
药剂
制药
生工
药剂制药
生工
药剂
制药
生工
药剂
生工
操作台（个）
8
4
8
4
8
8
8
4
4
管理实验员
王浩琦
/王习霞
王桂兰
/唐开华
王桂兰
/唐开华
王浩琦
/王习霞
刘洋
/曹慧君
刘洋
/曹慧君
王浩琦
/王习霞
刘洋
/曹慧君
刘洋
/曹慧君
生化实验室的开放时间表
时间
节
星期一
星期二
星期三
星期四
星期五
上午
1-2
4-16周开放6hr/日
8:
45±10分钟必须到实验室报到
3-4
4-16周开放6hr/日
10:
15±10分钟必须到实验室报到
中午
午休
下午
5-6
4-16周开放6hr/日
13:
30±10分钟必须到实验室报到
4-16周开放6hr/日
13:
30±10分钟必须到实验室报到
7-8
4-16周开放6hr/日
13:
30～15:
30必须到实验室报到
4-16周开放6hr/日
14:
15±10分钟必须到实验室报到
4-16周开放6hr/日
13:
30～15:
30必须到实验室报到
晚饭
晚上
9-10
11-12
加班人员
单周
唐开华/夏荣慧/顾永明
王浩绮/张玲/贺忠
王桂兰/张玲/周治
曹慧君/夏荣慧/梅艳珍
刘洋/张玲/王卫国
双周
王桂兰/夏荣慧/周治
王浩绮/张玲/贺忠
唐开华/张玲/顾永明
刘洋/夏荣慧/王卫国
曹慧君/张玲/梅艳珍
规则
1.同学们应至少提前2天到实验室预定或修改要做的实验，以便实验员做好准备，请大家务必不要按照讲课的顺序选实验，只要根据讲义和实验软件预习好了，就可来选做。
实验大楼429实验室是多媒体实验室，为同学们准备好了生化实验讲义和生化实验软件，全天开放，欢迎大家前来预习。
希望同学们尽量靠前安排做实验，不要拖到学期末。
2.一旦预定好了实验，就得守时，不许缺席，不许迟到，以免造成试剂浪费和影响下一轮同学做实验。
请同学们务必在规定的时间内到实验室找管理实验员报到。
报到时请出示预习报告，以便做完实验填上数据后立即交上。
3.实验前请注意看一下黑板的提示以及实验室内的有关标语。
4.实验1、3、5、6、7可各自同时开放8个操作台，实验2、4、8、9可各自同时开放4个操作台，每个操作台可容1组人做实验，每组1人。
实验一.粗脂肪的定量测定——索氏（SOXhlet）提取法
目的和要求
学习和掌握脂肪提取的原理和测定方法。
熟悉和掌握重量分析的基本操作。
原理
本法为重量法。
用脂肪溶剂将脂肪提取后进行称量。
该法适用于固体和液体样品。
通常将样品浸于脂肪溶剂，如乙醚或沸点为30℃至60℃的石油醚，借助于索氏提取器进行循环抽提。
用本法提取的脂溶性物质为脂肪类物质的混合物，其中含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、糖脂、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等，称为粗脂肪。
用该法测定样品含油量时，通常采用沸点低于50℃的有机溶剂作为脂肪溶剂。
此时，样品中结合状态的脂类（主要是脂蛋白）不能直接提取出来。
所以该法又称为游离脂类定量测定的方法。
样品的准备
称取样品的重量根据材料中脂肪的含量而定（参考表1-1）。
通常脂肪含量在10%以下的，称取样品10-20克。
脂肪含量为50-60%的，则称取样品2-4克。
表1-1几种干的植物种子和种仁中油脂的百分含量
样品
含油量%
样品
含油量%
向日葵种籽
向日葵种仁
蓖麻种籽
蓖麻种仁
芝麻种籽
油菜种籽
花生种仁
23.5-45.0
40.0-67.8
45.1-58.5
50.7-72.0
46.2-61.0
41.1-42.9
40.2-60.7
大豆种籽
油桐种仁
玉米谷粒
小麦谷粒
稻子谷粒
豌豆种籽
10.0-25.0
47.8-68.9
3.0-9.0
1.6-2.6
1.3-2.4
0.7-1.9
将样品在80℃-100℃电热鼓风干燥箱内烘去水分，一般烘4小时，烘干时要避免过热。
样品颗粒不宜太大，一般要在研钵中研碎样品。
样品若是液体，应将一定体积的样品滴在滤纸上，在60℃-80℃电热鼓风干燥箱内烘干后，在装入提取管中提取。
实验试剂
<1>.样品:
2g/组。
<2>.石油醚：
ＣＰ，沸程３０～６０℃，６０ml/组
实验设备和器材
<1>.BS2105型电子天平：
公用
操作指南：
插上电源，启动“ON/OFF”开关，按一下回零档“TARE”，使屏幕上显示0.0000，推开玻璃门，轻轻将样品置于称量盘上，关上玻璃门，待屏幕上显示的数字稳定后记录下来，即为样品的重量（g）。
注意：
每次称量前都必须按一下回零档“TARE”，使屏幕上显示0.0000；称量室内尤其是称量盘上必须保持清洁、干燥，若有药品撒落，立即用软毛刷清理干净。
<2>.HH-2型数显恒温水浴锅：
1台/2组
操作指南：
向水浴锅中注满自来水，盖好盖子，插上电源。
先将“设定/测温”选择开关置于“设定”档，调节“温度设定”旋钮使屏幕上的温度显示为所需的温度（本实验为85℃左右），此时黄灯亮，表示仪器正在加热。
然后将“设定/测温”选择开关置于“测温”档，此时屏幕上的温度显示为实际水温，当实际水温达到设定的温度时，仪器会自动恒温，此时绿灯亮。
在整个实验之前应该将恒温水浴锅的水温调节好。
<3>.电热鼓风干燥箱：
公用
<4>.索氏提取仪（50ml）（如下图所示）：
1套/组
由冷凝管、抽提管和平底烧瓶三个部件组成，通过标准磨口相对接
搭建装置（见示范样本）：
用铁架台、２只十字夹、２只龙爪、２根乳胶管和１套索氏提取仪来搭建装置，固定点分别是平底烧瓶的颈部和提取管的颈部，索氏提取仪的高度以平底烧瓶的瓶颈略高于恒温水浴锅的液面为宜。
注意：
用龙爪夹玻璃仪器时，要先用手找好感觉，不能太紧（那样会夹破）也不能太松（那样会打滑，致使索氏提取仪的标准磨口接口漏气）
<5>.其他器材：
不锈钢镊子、药勺、滤纸、铁架台1件/组、十字夹、龙爪、手套、乳胶管2件/组
学生操作
准备工作：
将恒温水浴锅的水温事先加热好，将干燥洁净的平底烧瓶（索氏提取仪部件之一）在电子天平上称重。
<1>.折滤纸斗：
戴上手套，取一张滤纸（φ11cm）,卷成筒状，再将其一端折起来封死，便做成了滤纸斗（见示范样本）。
<2>.称样：
先将滤纸斗在电子天平上称重，然后用药勺取２勺样品（约2克左右）装入滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死，调整滤纸斗的高度，使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处。
将装好样品的滤纸斗放在电子天平上称重，两重量之差即为样品的重量。
<3>.提取：
将索氏提取仪按照示范样本的方式安装好（参见样品，注意烧瓶的高度），把装有样品的滤纸斗放入提取管内，向平底烧瓶中注入约50ml的石油醚，检查一下，确保所有接口均对接完好（不漏气，不打滑），打开自来水（冷凝用），将索氏提取仪放入恒温水浴锅中加热（水温85℃左右）。
提取时间大约2个小时，记录提取的频率（虹吸一次的时间）和总提取时间，计算提取的次数。
附注：
一般样品的提取时间应该为12～24小时，由于实验时间的限制，我们的提取率只能达到80％左右。
<4>.回收石油醚：
提取2小时后，当石油醚在提取管中的液面即将达到虹吸管的上弯头处时，从水浴锅中取出索氏提取仪，室温冷却5～10分钟，取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中的石油醚会流入回收瓶中，达到回收的目的。
再装上平底烧瓶，继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下，表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。
取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚。
将平底烧瓶放入120℃的电热鼓风干燥箱中烘15分钟，取出冷却后称重（注意戴手套，以免烫坏手），它与空瓶的重量之差就是粗脂的重量。
<5>.从提取管中取出滤纸斗，将平底烧瓶用洗涤剂清洗干净，置于干燥箱中烘干，其它玻璃仪器放在桌面上，并注意清洁自己的操作台，请老师验收。
计算
样品粗脂的含量（%）=（粗脂的重量/样品的重量）*100%
记录与计算汇总：
滤纸斗重
滤纸斗+样品重
烧瓶重
烧瓶+粗脂重
样品重
粗脂重
样品中粗脂的含量
实验二.氨基酸的分离鉴定—纸层析法
目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶液由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的:
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
器材
（1）.层析缸或大烧杯（5000ml）:
1只/组
（2）.微量进样器（100ul）：
1只/组
（3）.喷雾器:
公用
（4）.培养皿：
1只/组
（5）.层析滤纸（长22厘米、宽14厘米的新华一号滤纸）:
1张/组
（6）.直尺、针、白线、铅笔、手套：
自备
（7）.电吹风：
1只/组
试剂
（1）.扩展剂：
为4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。
将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。
（2）.氨基酸溶液：
0.5%的已知氨基酸溶液3种（赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸），0.5%的未知氨基酸液1种。
（3）.显色剂:
0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
学生操作
（1）.剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20ml展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来（参见样品），平衡20分钟。
（2）.带上手套，取宽约14厘米、高约22厘米的层析滤纸一张。
在纸的一端距边缘2-3厘米处轻轻用铅笔划一条直线，在直线上每间隔2厘米作一记号，一共做4个记号，这就是原点的位置，见左下图。
（3）.点样：
用微量注射器分别取5ul的氨基酸样品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗一下微量注射器），点在这四个位置上。
挤一滴点一次，同一位置上需点2-3次，2-3ul/次，每点完一点，立刻用电吹风热风（注意：
电吹风不可压在其电源线上，以免烤焦）吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。
每人须点4个样，其中3个是已知的，1个是未知样品。
（4）.层析：
用针、线将滤纸缝成筒状（见右上图），纸的两侧边缘不能接触。
向培养皿中加入约80毫升扩展剂，并迅速置于倒置的层析缸或大烧杯中，将点号样的滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线约1厘米，见右上图），仍用塑料薄膜密封（参见样品）。
层析2小时左右后，溶剂上升约10厘米，取出滤纸，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。
（5）.显色：
用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点。
（6）.计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸。
将滤纸裁开，各人将自己的实验结果贴在实验报告上。
（7）.将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，用卫生纸擦干，并注意清洁自己的操作台，请老师验收。
计算：
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
记录与计算汇总：
赖氨酸
苯丙氨酸
缬氨酸
未知氨基酸
原点到层析斑点中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
Rf
判断未知氨基酸
实验三.血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。
原理
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法,醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。
目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和、同功酶的分离及用在免疫电泳中。
器材
1.醋酸纤维薄膜（2*8厘米）:
1片/人，即2片/组。
2.常压电泳仪：
1套/2组
操作指南：
电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。
电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。
每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥，两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就是搭在滤纸桥上，详见下面的“醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图”。
稳压电源用于调节电压和通电时间，当电泳槽和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，调整好电压，就可以通电电泳了。
注意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。
3.培养皿：
一排桌子（即4组）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。
4.点样器：
一个/组5.粗滤纸
6.玻璃板：
一块/组7.镊子：
一个/组
8.玻棒：
公用
试剂
1．巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.07）
巴比妥2.76克，巴比妥钠15.45克，加水至1000毫升。
2．染色液
含氨基黑10B0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重复使用）。
3．漂洗液
含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。
4．透明液
含无水乙醇7份，冰醋酸3份。
操作
1.浸泡：
用镊子取醋酸纤维薄膜2张，识别出光泽面与粗糙面，将粗面朝上放在缓冲液中浸泡20分钟。
2.点样：
事先用点样器在滤纸上点几个样，熟悉一下点样器的用法。
然后把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸内吸干表面多余的液体，粗糙面朝上平铺在玻璃板上，用玻棒蘸一点血清，再将点样器沾一下玻棒，则血清就会均匀地分布在了点样器的狭缝中，将点样器在膜条一端2～3cm处轻轻地垂直落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品，见下图。
每人点一个样。
3．电泳：
在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，做好滤纸桥（滤纸桥的制作如下：
先剪裁尺寸合适的滤纸，对折一下，一头凉在横杆上，另一头浸入缓冲液中，调节横杆之间的距离到略小于醋酸纤维薄膜的长度即可，这一步由老师准备好）。
用镊子将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。
膜条上点样的一端靠近负极。
当4片醋酸纤维薄膜都放好后，盖严电泳室，检查一下电泳槽和稳压电源是否已经连接好，通电。
调节电压至160V，此时的电流强度为0.4～0.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为40分钟。
以下4.、5.两步的操作，请相邻四个组的同学们集中一起做。
4．染色：
电泳完毕后，关上电源开关，用镊子将薄膜条取下并放在装有染色液的培养皿中浸泡10分钟（注意盖好培养皿的盖子）
5．漂洗：
将膜条从染色液中取出，在培养皿的边缘上沥去表面多余的染色液，依次放入装有漂洗液的培养皿（共有3套）中漂洗3次（未漂洗时注意盖好培养皿的盖子），至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。
试验至此结束，将染色液、缓冲液回收，漂洗液和平衡液倒掉，培养皿清洗干净，用卫生纸擦干水分，倒置于桌面上，并注意清洁自己的操作台，请老师验收。
下次交实验报告时请将自己的实验结果贴在实验报告上。
如果需要定量测定，可以将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4当量/升氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。
或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。
实验四.微量克氏（Kjeldahl）定氮法
目的
学习微量克氏定氮法的原理和操作技术。
原理
样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此过程通常称之为“消化”。
但是，这个反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。
若以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：
CH3NH2COOH+3H2SO4→3CO2+3SO2+4H2O+NH3
（1）
2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4
（2）
（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3（3）
反应
（1）、
（2）在克氏烧瓶中完成。
反应（3）在克氏蒸馏装置内进行。
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨。
借水蒸汽将产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。
然后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。
最后根据所用标准的克当量数计算出待测物中的总氮量。
试剂
（1）1%卵清蛋白溶液：
1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液，并稀释至100ml，如有不溶物，离心取上清液备用。
（2）浓硫酸（AR）
（3）硫酸钾3份与硫酸铜1份（W/W）混合研磨成粉末。
（4）30%氢氧化钠溶液：
30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。
（5）2%硼酸溶液：
2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml。
（6）混合指示剂：
0.1%甲基红酒精溶液和0.1%甲稀蓝酒精溶液按4：
1比例（V/V）混合。
（7）0.01N标准盐酸溶液：
用恒沸盐酸准确稀释。
实验设备和器材
1．微量克氏定氮仪（见下图所示）：
1套/组
2．克氏定氮烧瓶：
1只/组
3．电炉：
公用
4．微量滴定管（5ml）：
1只/2组
5．酒精灯：
1只/组
6．锥形瓶（100ml）：
4只/组
7．铁架台、十字夹、龙爪、打火机、表面皿、吸管、量筒、小玻璃珠等。
样品处理
某一固体样品中的含氮量是用100克该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。
因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。
一般样品烘干的温度都采用105℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的电热鼓风干燥箱内干燥4小时。
用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。
每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。
学生操作
12--
改良式微量克氏
定氮仪（蒸馏瓶）
1反应室2．蒸汽发生室
3．加样口的小漏斗
4．冷凝器5．自来水进口
6．冷凝水出口
7．蒸汽发生室加水口
8．废液排出口
9．锥形瓶10．出样口
11．酒精灯12．导管
（一）消化：
将两个50ml的克氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0ml蒸馏水，作为空白，另一只烧瓶内加入1.0ml样液（卵清蛋白液）。
然后用进样器各加浓硫酸2ml（取浓硫酸时当心勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上）、用药勺加硫酸钾---硫酸铜混合物约20mg，所有试剂均尽量加到克氏定氮烧瓶的底部。
烧瓶口插小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，注意启动抽风机，消化时间约为2小时。
在消化时可以同时进行
（二）1步。
（二）蒸馏：
取100ml锥形瓶3只，洗涤干净，用进样器各加入2%硼酸溶液5.0ml,盖好备用。
如锥形瓶内液体呈绿色，需重新洗涤。
安装好微量克氏定氮仪，微量克氏定氮仪实际上是一套蒸馏装置（如图所示），装置的搭建见示范样本。
1.蒸馏瓶的洗涤：
将自来水由（5）经（7）注入到蒸馏瓶夹层（即蒸汽发生器）
（2）中，使水面稍低于蒸馏瓶颈部的转弯处。
把装有蒸馏水的锥形瓶（9）置于冷凝器（4）下方，并将冷凝器下方的导管（12）下端插入锥形瓶液面以下，再将少量蒸馏水由漏斗（3）注入到蒸馏瓶的反应室
（1）中，把所有夹子夹紧。
打开冷凝水，用酒精灯（11）将蒸馏瓶夹层
（2）内的水煮沸，然后移去火源，锥形瓶（9）中的蒸馏水就会从冷凝器下方的导管（12）倒流到蒸馏瓶的反应室
（1）内，再倒流至蒸馏瓶的夹层
（2）中，可以由废液排出口（8）排出。
按照上述方法将仪器洗涤2～3次。
最后，反应室
（1）中的余液可以按下法清空：
把所有夹子夹紧，将蒸馏瓶夹层
（2）内的水煮沸，先移去锥形瓶（9）,然后移去火源，反应室
（1）中余液将倒流至夹层
（2）中，由（8）排出。
以后每次在做下一次蒸馏之前都要先将蒸馏瓶洗涤2～3次，并将反应室
（1）清空。
2.样品的蒸馏：
把装有5.0ml的2%硼酸溶液的锥形瓶（9）置于冷凝器的下方，将冷凝器下方的导管（12）下端插入液面以下，锥形瓶内须事先加入指示剂（注意此时的颜色，它将是后面滴定终点的颜色）。
先将克氏烧瓶中消化好了的消化液由小漏斗（3）注入到蒸馏瓶的反应室
（1）中，用蒸馏水洗涤克氏烧瓶二次（每次约2ml），洗涤液皆由漏斗（3）注入反应室
（1），用小量筒取30%氢氧化钠溶液15ml，倾入小漏斗，放松夹子，让缓缓流入反应室
（1），当小漏斗内仍有少量NaOH溶液时，立即夹紧夹子（以上操作当心勿将NaOH溶液溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上）。
再加约3ml蒸馏水于小漏斗内，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。
把所有夹子夹紧,打开冷凝水，开始用酒精灯加热，将蒸馏瓶夹层
（2）内的水煮沸。
从蒸馏瓶内的水溶液沸腾开始计算时间，大约10分钟即可蒸馏完毕。
将导管（12）的下端抽出液面，继续蒸馏1分钟，使导管内的余液落回锥形瓶（9）中，移开锥形瓶，用表面皿盖好等待滴定。
移去火源，反应室
（1）中的残液将会倒流至夹层
（2）中，由（8）排出。
注意，在样品蒸馏的整个过程中，严禁中途移去火源，以防倒吸。
在做下一次蒸馏之前先将蒸馏瓶洗涤2～3次，并将反应室
（1）清空。
（三）.滴定：
用0.01NHCl溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色（也就是前面加了指示剂后的标准酸溶液的颜色）。
记录所
升级会员 