蛋白质双向电泳实验报告.docx
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蛋白质双向电泳实验报告
现代生物学技术实验报告
题目
蛋白质双向电泳技术
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中国·武汉
年月
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大肠杆菌组蛋白双向电泳技术
摘要：
蛋白质双向电泳是一种等电聚焦与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术，也是蛋白质组学研究中分离纯化蛋白质的主要方法之一。
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在等电点上的差异，而垂直方向反映出他们在分子量上的差别。
本实验通过学习蛋白质双向电泳技术，熟悉了蛋白质双向电泳的简单流程。
可以根据电泳所得的图像分析，分离蛋白质。
关键字：
蛋白质双向电泳等电聚焦电泳SDS-PAGE
前言：
蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。
双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化.双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离.目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10000个斑点（spot）.当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。
本实验是要研究大肠杆菌中的蛋白质，并学习和初步掌握双向电泳技术。
正文：
1）实验原理：
从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：
等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度
环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：
SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质－SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。
在构象上，蛋白质－SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质－SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于相对分子质量的大小，从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）来测定蛋白质的相对分子质量。
单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。
在SDS - PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带。
2）实验步骤：
1.样品制备：
1.1蛋白样品制备方法（TCA-丙酮法）
1、收集50mL菌液于离心管中，12000rpm，4℃离心一分钟
2、倒掉上清，加10mLPBSbuffer洗涤菌体一次，12000rpm，4℃离心一分钟
3、去上清，加20mLPBSbuffer悬浮菌体，加入蛋白酶抑制剂（cocktail一片），混匀
4、超声波破碎仪或压力破碎仪破碎细胞，至菌体悬浮液变澄清
5、12000rpm，4℃离心10min，去除细胞碎片。
6、将上清转移到新的离心管中，加入适量的核酸酶，混匀，室温放置20min，以除去样品中的核酸。
7、取0.9mL样品裂解液分装到1.5ml离心管中，并在离心管中加入0.3ml40%的TCA（每组做4管，做好标记）。
8、混匀后，放置在冰上5min。
9、12000rpm，4℃离心10min，倒掉上清
10、加入1ml丙酮洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心5min，重复三次
11、最后倒出丙酮后，再短暂离心，用移液枪吸出残余的丙酮
12、打开离心管的盖子，室温放置10-15min，使丙酮完全挥发
13、向离心管中滴加50ul样品溶解液，4℃放置至少3h，溶解蛋白样品。
1.2制备蛋白样品所需试剂
1．细胞洗涤液PBSbufferPH7.4
氯化钠8g
氯化钾0.2g
Na2HPO41.42g
KH2PO40.27g
向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解
滴加浓盐酸将PH值调至7.4，然后加入去离子水定容至1L.
灭菌后室温保存
2．蛋白沉淀剂40%三氯乙酸（TCA）
40gTCA加水定容至100ml
3．丙酮
4．核酸酶
5.蛋白酶抑制剂（cocktail，片剂）
6．样品溶解液：
尿素7M4.2g
硫脲2M1.52g
CHAPS4%0.4g
MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
注：
不要反复冻融，分装保存
1.3蛋白定量
1.3.1蛋白定量方法
标准曲线法测定蛋白质的含量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白液（mL）
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
蒸馏水（mL）
1
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
考马斯亮蓝G-250（mL）
4
4
4
4
4
4
蛋白含量（μg）
0
10
20
40
60
80
OD595nm
0
0.128
0.308
0.448
0.617
0.846
步骤：
1、取7个1.5ml的离心管，标记管号1-7
2、在1-6号管中，按上表加入标准蛋白液（0.1mg/mlBSA），蒸馏水，考马斯亮蓝R250，混匀后室温放置5min
3、从冰箱中取出溶解的蛋白样品，用移液枪反复吹打几次，12000rpm，4℃离心10min，之后将上清转移到一新的离心管中
4、取合适体积的蛋白样品加入7号管中，加蒸馏水补足至1ml，考马斯亮蓝G-2504mL，混匀后室温放置5min.
5、用分光光度计测得1-7号管中溶液的光密度OD595nm，（测之前注意调零，以1号管为空白对照调零）
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10µg、20µg、30µg、40µg、50µg），在坐标轴上绘制标准曲线。
6、利用标准曲线查出回归方程A595nm=aX+b。
7、根据回归方程计算样品蛋白质含量
实验结果：
经试验得知：
标准曲线方程为Y=0.0101X+0.0416
其中，Y：
吸光度（OD595nm值）
X：
蛋白质含量（g）
2.第一向分离——等电聚焦
2.1上样方法
1.从-20℃取出保存的水化上样缓冲液，置室温溶解。
2.从小管中取出水化上样缓冲液，加入适量样品、两性电解质（终浓度0.5-1%）和溴酚蓝，充分混匀。
3.沿着聚焦盘中槽的边缘从左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：
不要产生气泡。
否则影响
到胶条中蛋白质的分布。
4.取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cmpH3-10），室温中放置10分钟。
而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
5．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。
6.在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油（根据不同胶条长度,本实验1.5ml），
防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7.对好正、负极，盖上盖子。
将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
7cm胶条
水化12小时（20℃）主动水化（50V）
S1250V线性30分钟除盐
S2500V快速30分钟除盐
S34000V线性3小时升压
S44000V快速20,000伏小时聚焦
S5500V快速任意时间保持
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。
（50A/根）
设置等电聚焦时的温度。
（17℃）
2.2蛋白质上样量
双向电泳第一向上样蛋白质量
IPG胶条的长度
分析型的上样量
（银或SYPRORuby染色）
制备型的上样量
（考马斯亮蓝染色）
7cm
10-100ug蛋白
200-500ug蛋白
11cm
50-200ug蛋白
250-1,000ug蛋白
17cm
100-300ug蛋白
1-3mg蛋白
样品溶液的上样体积
ReadyStripTMIPG胶条的长度
上样体积
7cm
125ul-250ul
11cm
185ul-370ul
17cm
300ul-600ul
我组试验中所得到的蛋白质量的数据为：
蛋白质的加入量为4ul，所测蛋白质的吸光度为0.354，由标准曲线公式可以得出所测蛋白质含量为30.93ug。
经查表得：
在200-500ul中取300ul，那么待测蛋白的点样量为40ul，即在步骤2.1.3中的样品量为40ul。
2.3水化上样缓冲液配制：
水化上样缓冲液成分：
尿素7M
硫脲2M
CHAPS4%
DTT50mM
Benzonase0.3U/ul
PMSF1mM
CarrierAmpholytes0.2%（w/v）
溴酚蓝0.001%
水化上样缓冲液母液配方：
尿素7M4.2g
硫脲2M1.52g
CHAPS4%0.4g
DTT50mM500ul（1MDTT）
Benzonase0.3U/ul120ul
PMSF1mM100ul
MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
（1M的DTT：
1M的DTT每mL含DTT0.154g）
CarrierAmpholytes0.2%（w/v）50ul（40%）（现加）
溴酚蓝0.001%10µl（1%溴酚蓝）（现加）
2.4配制蛋白上样缓冲液：
蛋白溶解液适量（根据所制蛋白样品浓度）
上样缓冲液母液适量（根据蛋白样品体积）
CarrierAmpholytes0.2%（w/v）1ul（40%）（现加）
溴酚蓝0.001%1ul（1%溴酚蓝）（现加）
混匀之后，12000rpm，4℃条件下，离心2min，即可用于上样。
3.胶条的平衡
3.1胶条平衡方法
1.从聚焦盘或-20℃冰箱中取出的胶条，若直接从聚焦盘中取出胶条，可立即进行后续处理，如果是从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10-15分钟平衡。
2.在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，吸取胶条上的矿物油。
用镊子夹住胶条的一端（不要碰到胶面），用蒸馏水缓缓冲洗胶条，洗去胶条上残留的矿物油和多余样品，这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
然后将胶条胶面朝上放在干净滤纸上。
3.准备好干净的胶条溶胀盘，将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入根据胶条长度加入平衡缓冲液I。
将溶胀盘放在水平摇床上平衡15分钟。
5.第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液l。
并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
6.用镊子夹住胶条的一端，取出胶条，同样用蒸馏水缓缓冲洗胶条，洗去多余的平衡液，然后将胶条胶面朝上放在干净滤纸上。
3.2胶条平衡液配方
胶条平衡缓冲液母液：
尿素6M36g
SDS2%2g
Tris-HCl0.375MpH8.825ml（1.5MpH8.8Tris-HCl）
甘油20%20ml
MilliQ水定容至100ml；分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液I：
胶条平衡缓冲液母液10ml
DTT0.2g充分混匀，用时现配。
胶条平衡缓冲液II：
胶条平衡缓冲液母液10ml
碘乙酰胺0.25g充分混匀，用时现配。
4.第二向分离——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.1聚丙烯酰胺凝胶的配制、胶条的转移及电泳
1.配制12%的凝胶1块。
配10ml凝胶溶液，将溶液分别注入玻璃板夹层
中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，聚合至少1小时。
（7cm胶条）
2.用滤纸吸去上方玻璃板间多余的液体。
将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
3.将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。
4.将10×电泳缓冲液稀释成1×电泳缓冲液。
赶去缓冲液表面的气泡。
6.将平衡好的IPG胶条完全浸末在1×电泳缓冲液中。
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
7.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。
8.用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，不要在胶条下方产生气泡。
9.之后在IPG胶条上注入低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。
10.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时低电压（80V），待样品在完全走出IPG胶条，再加大电压至（120V），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
4.2聚丙烯酰胺凝胶试剂配制
低熔点琼脂糖封胶液：
低熔点琼脂糖0.5%0.5g
Tris25mM0.303g
甘氨酸192mM1.44g
SDS0.1%1ml（10%SDS）
溴酚蓝0.001%100µl（1%溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml；加热溶解至澄清，室温保存。
30%聚丙烯酰胺贮液：
丙烯酰胺150g
甲叉双丙烯酰胺4g
MilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/LTrispH8.8：
Tris90.75g
MilliQ水400ml用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。
4℃冰箱保存。
10%SDS：
SDS10g
MilliQ水100ml混匀后，室温保存。
10%过硫酸铵Ap0.1g
MilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4℃冰箱保存。
10×电泳缓冲液（1×=25mMTris，192mMglycine，0.1%SDS，pH8.3）
Tris30g
甘氨酸144g
SDS10g
MilliQ水1L混匀后，室温保存。
分离胶配方
10%分离胶10ml
30%凝胶母液3.3ml
1.5MTris2.5ml
ddH204ml
10%SDS100μl
10%APS（新备）100μl
TEMED4μl
依次缓慢加入上述试剂，轻轻摇匀后注入已封好的制胶板中，顶部预留0.5cm左右的空间，加正丁醇或纯水压平胶面。
5.凝胶染色——考马斯亮蓝染色
1 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，清水漂洗后放入染色盘中
2 在染色盘中加入适量染色液，放置在摇床上，过夜染色
3 第二天，倒掉染色盘中的染色液，加入适量脱色液进行脱色，每隔两小时更换一次脱色液，直到脱色完全为止。
染色液
0.1%考马斯亮蓝R-2501g
25%异丙醇250mL
10%冰醋酸100mL
加蒸馏水定容至1L，滤纸过滤后室温保存
脱色液
10%醋酸100ml
5%乙醇50ml
加蒸馏水定容至1L，混匀后室温保存
6.凝胶的图像处理和照片分析
1 凝胶图像的扫描
2 图像加工
3 斑点检测和定量
4 凝胶配比
5 数据分析
6 数据呈递和解释
3）实验结果：
1.蛋白质含量标准曲线图如下：
测得此种蛋白质的吸光度为0.399。
根据方程式计算出对应的蛋白质含量为44.2mg。
2.SDS-PAGE分析
出现了严重的拖尾现象，说明样品中有多糖类和一些去污剂，DTT等类型的杂质，说明实验操作的过程中有些步骤的时间长短和试剂的剂量没有把握好。
出现了大量的蛋白斑点，说明溶解蛋白不充分。
应当添加多一些的溶解试剂和加长蛋白溶解时间。
4）参考文献
【1】生物化学王镜研编
【2】大肠杆菌可溶性蛋白质双向电泳条件的建立中国现代教育装备2010年第五期尹燕霞赵长云刘照蓬徐风亭刘进李森向本琼作
【3】蛋白质组学研究中的核心技术---双向凝胶电泳首席医学网2006年4月张曼作
【4】双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用2012-11-29 中图分类号Q75；Q945.7文献标识码A文章编号1007-5739（2012）20-0013-02
【5】.蛋白质双向电泳图像分析[J].生物化学与生物物理进展贾宇峰，林秋霞，郭尧君，等，2001
（2）：
246-250.
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