临床基因扩增检验的质量控制与持续改进-刘晓春.ppt

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临床基因扩增检验的质量控制与持续改进,广西临床检验中心刘晓春2012.5.16,临床实验室检测的目的：

为疾病的诊断、预防、治疗和疗效观察，或对健康状况评估提供必要的信息。

要求：

检验结果必须准确,质控所起的作用,火警报警器？

！

质控-错误检测器,临床基因扩增检验实验室常规测定步骤,标本收集：

选择测定项目、标本收集和保存。

实验室测定：

标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。

报告和解释：

结果发出、结果解释和临床管理。

标本采集,标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集部位的准备标本的类型和采集量采样质量的评价采样及运输容器标本采集中的防污染,标本采集时间对扩增检测结果的影响,在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。

标本采集部位的准备,血液标本采集分泌物标本:

采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物,但应适度,过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物,故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。

标本的类型和采集量,标本的类型:

血清（浆）、分泌物、痰、粪便、尿和脑脊液等。

标本的采集量:

应根据所测病原体而定。

一般来说，如果标本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。

对于定量测定来说，对标本的收集要求更为精确。

采样质量的评价,血清（浆）标本:

溶血、脂血等；分泌物、痰：

评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。

评价方法：

包括肉眼观察,显微镜下观察和化学分析等。

采样及运输容器,标本的采集材料如棉签应为一次性使用；采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置；采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。

标本采集中的防污染,采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等；如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase失活。

标本运送,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。

样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清（浆）样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。

实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。

标本保存,靶核酸（尤其是RNA）易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。

使用GITC作为稳定剂保存标本，标本可在室温下稳定约7天。

标本保存,临床体液标本长期保存应在-70下。

如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10mmol/LTris,1mmol/LEDTA（pH7.58.0）缓冲液中4下保存。

用于RNA扩增分析的样本，则应于上述缓冲液中-80或液氮下保存。

核酸的乙醇沉淀物则可于-20下保存。

医疗机构临床实验室管理办法,第三章医疗机构临床实验室质量管理,第二十五条医疗机构临床实验室应当对开展的临床检验项目进行室内质量控制，绘制质量控制图。

出现质量失控现象时，应当及时查找原因，采取纠正措施，并详细记录。

第二十六条医疗机构临床实验室室内质量控制主要包括质控品的选择，质控品的数量，质控频度，质控方法，失控的判断规则，失控时原因分析及处理措施，质控数据管理要求等。

第二十七条医疗机构临床实验室定量测定项目的室内质量控制标准按照临床实验室定量测定室内质量控制指南（GB/20032302-T-361）执行。

室内质量控制工作流程,IQC操作,选择质控物,绘制质控图,确定质控限,记录数据,选择规则,管理数据,室内质控的目的,1、检测、控制本实验测定工作的精密度2、检测其准确度的改变3、提高常规测定工作的批间、批内标本检测结果的一致性,基本统计量,算术平均数方差总体方差样本方差标准差变异系数（CV）：

Z-分数,正态分布,当分析一质控样本时，可获得可变化的值。

由于测定的随机误差（所有测定过程的特征）可导致结果的差异。

当用稳定的方法对质控样本检测得到足够的结果时，结果的分布接近正态分布。

一般来说，可假定质控样本的值是正态分布。

结果的分布因此可以用平均值和标准差来描述。

正态分布的特征,正态曲线下面积的分布规律1的面积占总面积的68.2%2的面积占总面积的95.5%3的面积占总面积的99.7%,临床基因扩增检验的室内质量控制,测定前的质量控制核酸样本的制备及其质量控制统计学质量控制质量控制的评价,测定前质量控制,实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法人员培训,实验室设施、仪器设备及管理,临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备；实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。

加样器的校准？

带滤塞吸头的使用及质检？

离心机？

热循环仪？

水浴箱和/或恒温干浴仪？

酶标仪和洗板机？

基因扩增仪器设备的质控,带滤芯吸头的使用及质检,首先制备一个含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸头的最大体积为100l，则将加样器吸取体积调至110120l，再套上吸头后吸取上述有色液体。

如果吸头质量好，则有色液体不应出现在滤芯之上，否则说明滤芯不严。

抑制物质检试验,核酸提取用离心管质检,离心管PCR抑制物质检其他,扩增仪孔间温度的重复性和均一性,一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1时，其可测出来。

具体做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中，然后按程序进行一个常规的PCR扩增，加热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。

扩增仪孔间温度的重复性和均一性,第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。

理想的试剂和操作方法,试剂盒的质检定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根（SD）=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差,人员培训,临床基因扩增检验的操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，这其中所涉及的又主要是加样器的使用，尽管操作简单，但由于均为微量操作，要获得稳定可靠的测定结果，操作人员需要一定的专业技术知识和经验.知其然又知其所以然。

统计学质量控制,理想的室内质控样本的条件测定中质控样本的设置、数量及排列顺序统计学质控的特点统计质控方法,理想的室内质控样本的条件,基质与待测样本一致；所含待测物浓度接近试验的决定性水平；稳定；靶值或预期结果已定；无已知的生物传染危险性；单批可大量获得；价廉,质控物浓度的选择,定量测定：

测定线性范围内的高、中、低三种浓度定性测定：

接近方法测定下限的浓度阴性质控物,临床基因扩增检验IQC统计计算问题,可使用质控样本扩增后的IU/ml来进行统计计算，也可用其对数值进行。

由于基因扩增结果的原始数据通常很大，可能不呈正态分布，故使用其对数值来进行质控统计分析。

每次（批）测定质控物的数量及放置,标本数量如小于30，弱阳性和阴性质控各1份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取）扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。

但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。

阴性质控样本的种类,阴性原血清样本实验过程中带入的空管仅含扩增反应混合液的管,阴性原血清样本的功能,监测实验室的以前扩增产物的“污染”由实验操作所致的标本间的交叉污染。

具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等扩增反应试剂的污染。

核酸提取过程中带入的空管,监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在（在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增）,仅含扩增反应混合液的管,监测试剂的“污染”,实验室是否发生污染的鉴别,可将一个或多个空管打开静置于标本制备区3060分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。

质控规则的表达方式及定义,质控规则的表达方式质控规则的功能常用质控规则的符号及定义,质控规则的表达方式,通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。

当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。

常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：

在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。

质控规则的功能,简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。

常用质控规则的符号及定义,符号定义12S一个质控测定值超出2s控制限。

13S一个质控测定值超出3s控制限。

22S两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。

R4S同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限。

41S四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。

7T七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。

10X十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。

控制图,控制图的定义:

是对过程质量加以测定、记录从而进评估和监察过程是否处于控制状态的一种统计方法设计的图。

图上有中心线（centralline,CL）、上控制界限（uppercontrollimit,UCL）和下控制界限（lowercontrollimit,LCL），并有按时间顺序抽取的样本统计量值的描点序列。

控制图的功能,诊断：

评估一个过程的稳定性。

控制：

决定某一过程何时需要调整，何时需要保持原有状态。

注意这一内容实际指：

当过程发生异常质量波动时必须对过程进行调整，采取措施消除异常因素的作用（严加控制）。

当过程能够稳定在合理的正常质量波动状态时，就应保持这种状态。

确认：

确认某一过程的改进效果。

Levey-Jennings控制方法常用控制规则,报警规则：

12S失控规则：

13SLevey-Jennings质控方法是临床检验质控工作最简单、也最常用的方法，它方便易行但却相对的简单粗糙，往往不能满足更高的质控要求,Westgard多规则通常有六个质控规则，即12s，13s，22s，R4s，41s，10X质控规则。

其中13s、R4s规则检出随机误差；22s、41s、10X规则检出系统误差。

“即刻”质控方法,“即刻法”的实质是一种统计学方法,即Grubs异常值取舍法只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。

可能的几种失控表现,曲线向上漂移：

提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等向上的趋势性变化：

可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。

此时实验室需要进行彻底清洁。

室内质量控制的评价,IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。

IQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。

对IQC应定期进行评价。

阳性质控样本失控的常见原因,核酸提取中的随机误差。

如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留、所用耗材如离心管有PCR抑制物等。

仪器的问题。

如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。

试剂的问题。

如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。

避免假阴性的措施,纯化核酸标本重复双份测定稀释标本使用“内质控”（InternalControl,IC）,阴性质控样本的常见失控原因,扩增产物的“污染”临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”,避免PCR检验假阳性结果的措施,严格的实验室分区使用带“滤芯”的吸头设立“阴性”质控（与标本同时处理）使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂临床“假阳性”问题：

病原微生物如结核杆菌、淋球菌等经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。

IQC的局限性,IQC可能测不出的误差测定前测定中测定后样本鉴定不对样本吸取不对结果记录错误样本贮存中变质试剂加入不对此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于0.1%，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。

室内质量控制存在的问题,概念不清不知道具体怎么做不会写室内质控的SOP不知道如何选择室内质控物不会分析室内质控的结果,IQC程序编写普遍存在的问题,质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。

有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。

没有明确所选用的质控方法。

对前20次的测定的室内质控没有解决方法。

没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。

并且一般都没有阴性失控的判断方法。

没有失控后的分析及处理措施。

质控均值与标准差的设置问题,需进行指数结果的对数化！

参照质控物说明书标示值设定均值与标准差；现象：

质控结果往往偏于均值一侧；设定标准差比实测标准差高出数倍；每月更换新批号质控物；,一次订购较多数量的质控物，在质控物效期内可连续使用较长时间；对质控数据进行累积计算，取得累积均值与累积标准差。

哪些项目需做室内质控,现状：

实验室开展项目多，但开展室内质量控制的项目少。

对于常规开展的项目应该定期进行室内质量控制。

定量与定性,室间质量评价（ExternalQuanlityAssessmentEQA）,是由第三方采用一系列办法来客观地评价实验室的结果，是一种回顾性评价。

EQA的主要目的并不是用来观察日间精密度，而是为了建立实验室间的比较。

作为一种质量控制工具可以识别实验室间的差异,评价实验室的检测能力。

各参加实验室通过分析实验中存在的问题,采取相应的改进措施,从而提高检验质量。

EQA工作流程,室间质评样本的检测要求,实验室必须与其测试患者样本一样的方式来检测室间质评（EQA）样本。

室间质评样本必须按实验室常规工作，由进行常规工作的人员测试，工作人员必须使用实验室的常规检测方法。

实验室在检测EQA样本的次数上必须与常规检测患者样本的次数一样。

室间质评样本的检测要求,实验室在规定回报EQA结果给EQA组织者截止日期之前，实验室一定不能进行关于室间质评样本结果之间的交流。

这包括由多个检验场所或者有分开场所之间的实验室交流。

实验室一定不能将EQA样品或样品一部分送到另一实验室进行分析。

室间质评样本的检测要求,实验室进行EQA样品检测时，必须将处理、准备、方法、审核、检验的每一步骤和结果的报告文件化。

实验室必须保存所有记录的复印件至少2年，这包括EQA结果的记录表格（包括EQA计划的说明、实验室主任和分析人员的签字、EQA样本与患者样本一样处理的文件）。

EQA要求只用作患者测试的主要方法的试验室系统，检测方法进行EQA样本的检测。

室间质量评价成绩的评价方式,1、对每一次EQA调查，针对某一项目的得分计算公式为：

2、而对评价的所有项目，其得分计算公式为：

针对单项：

PT80%为合格;PT80%为不合格；针对所有项目：

PT80%为合格;PT80%为不合格。

临床基因扩增检验评价标准,HBV-DNA靶值2s（s0.25）UU-DNA阳性或阴性CT-DNA阳性或阴性,室间质量评价未能通过的原因,校准和系统维护计划失败；室内质量控制失控；实验人员的能力欠缺；结果的评价、计算和抄写错误；室间质评样本处理不当，如冻干质控物的复溶、混合、移液和储存不当；室间质评样本本身存在质量问题；室间质评组织者公议值或靶值定值不准。

【质评返馈分析】,收到返馈报告后要及时分析，检查各项目的准确程度、有无系统性误差、有无不合格项目，对不合格项目需要分析失误的原因。

1、质评物来源：

国产质控物。

2、质评物发放与检测：

由广西临床检验中心统一发放质评物，一年发放二次，并要求参评实验室在规定时间内回报结果。

3、评价项目：

评价项目：

HBV-DNA定性与定量CT-DNA定性UU-DNA定性（2011年）4、评价方法：

PT评价。

5、具体情况：

2011/2012年参评实验室分别为59/60所。

2011年合格实验室56所，合格率94.92%2010年合格率91.38%；不合格实验室5所。

2011年各项目每次活动及年度总评情况,HBV-DNA定量：

靶值2SD，SD0.25,HBV-DNA定量：

靶值2SD，SD0.25,HBV-DNA定量：

靶值2SD，SD0.25,SD0.25,UU在不同试剂组的结果差异问题,CT在不同试剂组的结果差异问题,CT在不同试剂组的结果差异问题,结果的报告问题,特别提醒：

各实验室应该检查实验室PCR项目报告单的报告格式是否符合临床基因扩增检验实验室管理办法的要求！

HBV-DNA定量检测，低于检测下限的结果应该报告为“低于检测下限”，EQA结果则填写为“0”；UU-DNA、CT-DNA等定性检测结果应该报告为“阴性”或“阳性”，不能报告为定量的数据！

PCR实验室质量控制情况分析,标准曲线,1、不是每次实验都进行标准曲线检测，而是每批试剂检测一次或周期性（周、月）；标准曲线导入！

要求：

每次检测均需进行标准曲线检测。

2、多个项目同时检测时，只做某一项目的标准曲线，用该标准曲线分析所有项目的结果；,标准曲线的设置要求,通过基线和荧光阈值线的调整应达到：

相关系数（r值）0.99斜率-3.0-4.0截距-404（这些参数根据仪器和试剂有所不同）,阈值设置问题,结果分析软件设置阈值默认值，实验室在分析结果时，没有根据实际情况进行相应调整，导致结果偏高或偏低。

项目SOP文件,试剂说明书版本更新后，实验室未能及时调整SOP文件；扩增程序改变报告单位copies/ml、IU/ml,谢谢,