RNA分子生物学技术课件.ppt

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RNA研究相关技术RNAresearch-relatedtechniquesandtheirapplication（进展）2010级硕士,徐文弟2010年9月28日,导论,再谈中心法则RNA世界RNA生物学功能RNA组学,再谈中心法则,4,中心法则与RNA,1961年,发现DNA依赖的RNA聚合酶,1968年,提出RNA是最早的信息分子,19821983年,发现核酶,1986年,提出“RNAworld”,1947年,RNA第一次被描述,1968年,提出中心法则,中心法则与组学,基因组：

一种生物拥有的所有遗传信息的总合,是一个细胞（或病毒）所承载的全部遗传信息，它代表了一种生物所具有的全部遗传信息。

真核生物基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）及线粒体DNA或叶绿体DNA的全部序列，既有编码序列，也有大量存在的非编码序列。

细菌基因组包含了拟核和质粒中的DNA序列。

病毒基因组有的为DNA（DNA病毒），有的则为RNA（RNA病毒）。

*基因组（genome）,基因组学：

包括结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学,基因组学（genomics）是阐明整个基因组的结构、结构与功能的关系以及基因之间相互作用的科学。

研究内容：

结构基因组学（structuralgenomics）:

遗传图谱、物理图谱、序列图谱以及转录图谱和大规模DNA测序。

功能基因组学（functionalgenomics）:

分析鉴定基因组功能。

比较基因组学（comparativegenomics）：

基因组之间比较鉴定，研究生物进化，预测新基因。

转录组学：

研究全部RNA的表达及功能,转录组（transcriptome）指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的所有RNA包括指导蛋白质翻译的mRNA和非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）的总和。

RNA功能基因组学又称RNA组学（RNomics）：

是分析、鉴定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定状态下表达差异、功能及其与蛋白质的相互作用。

RNA组学：

研究全部非mRNA小RNA的集合,人类基因组序列特点：

2万2.5万个基因，与蛋白质合成有关的序列占整个基因组的2%左右，其余98%的基因组序列没有得到注释。

RNA组学研究范畴：

小分子RNA，包括snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）,以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质即蛋白质组（proteome）为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态；了解蛋白质之间的相互作用与联系；并在整体水平上研究蛋白质调控的活动规律，故又称为全景式蛋白质表达谱（globalproteinexpressionprofile）分析。

蛋白质组学（proteomics）,蛋白质组：

全景式蛋白质表达谱分析,蛋白质组学的中心任务：

研究细胞内所有蛋白质组成及其活动规律,蛋白质组学的研究内容：

一、蛋白质组表达模式的研究，即结构蛋白质组学（structuralproteomics）二、蛋白质组功能模式的研究，即功能蛋白质组学（functionalproteomics）,蛋白质组学的主要任务：

蛋白质鉴定：

可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。

翻译后修饰的鉴定：

磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。

蛋白质功能确定：

包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。

与蛋白质组研究相关的数据库,蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http:

/www.expasy.ch）基因序列数据库（Genbank，http:

/www.ncbi.nlm.nih.gov/EMBL，http:

/www.ebi.ac.uk/）蛋白模式数据库（Prosite，http:

/www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，http:

/www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http:

/www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASEhttp:

/www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）,疾病基因组学：

研究疾病相关基因、揭示疾病发病机制,疾病基因组学研究的两大任务：

疾病基因或疾病相关基因疾病易感性的遗传学基础,药物基因组学：

研究遗传变异对药物效能和毒性的影响,药物基因组学（pharmacogenomics）是功能基因组学与分子药理学的有机结合，它不是以发现人体基因组基因为主要目的，而是运用已知的基因组学知识改善患者的治疗。

以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性的关系，是研究高效、特效药物的重要途径，通过它为患者或者特定人群寻找合适的药物。

使药物治疗模式：

诊断定向治疗基因定向治疗。

肿瘤基因组解剖工程：

阐明肿瘤相关基因,基因激活和/或失活及其复杂的相互作用是肿瘤发生的根本原因癌症基因组解剖计划（CancerGenomeAnatomyProject，CGAP；又称肿瘤cDNA工程）：

拟逐步建立人类肿瘤细胞表达基因索引发展快速分析肿瘤细胞的技术获知与肿瘤相关的基因、蛋白质及其他生物标记物建立肿瘤研究信息（数据与分析工具）、资源（克隆和文库）及技术和方法学平台,代谢组学（metabonomics）测定一个生物/细胞中所有小分子（Mr1000）组成，描绘其动态变化规律，建立系统代谢图谱，并确定这些变化与生物过程的联系。

生命过程的表观、生物化学的终极目标。

代谢组学：

研究内源性代谢物质的动态变化规律及与生物过程的联系,代谢组学分为4个层次：

代谢物靶标分析（metabolitetargetanalysis）代谢谱分析（metabolicprofilinganalysis）代谢组学（metabonomics）代谢指纹分析（metabolicfingerprintinganalysis）代谢组学研究对象：

生物体液血样、尿样等完整的组织样品、组织提取液和细胞培养液,

（一）代谢组学的任务：

分析生物/细胞代谢产物的全貌,主要的分析工具核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）：

氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）及磷谱（31P-NMR）。

MS：

MS按质荷比（m/z）进行各种代谢物的定性或定量分析，可得到相应的代谢产物谱。

色谱及联用技术：

使样品的分离、定性、定量一次完成，具有较高的灵敏度和选择性。

（二）代谢组学的主要分析工具：

核磁共振、色谱及MS,代谢组学研究侧重于代谢物的组成、特性与变化规律，与生理学的联系更加紧密。

疾病机体病理生理过程变化代谢产物的改变比较分析与正常人的代谢产物差异发现和筛选出疾病新的生物标记物对相关疾病作出早期预警发展新的有效的疾病诊断方法。

药物代谢组学的研究，可阐明药物在不同个体体内的代谢途径及其规律，将为合理用药和个体化医疗提供重要依据。

（三）代谢组学：

是开展预测医学和个体化医学的重要手段,RNA世界,RNA是一种可以作为信使、酶和结构组分的多功能分子。

RNA与DNA、蛋白质，甚至RNA本身都能发生相互作用，在生命活动的各个环节中发挥重要功能。

大量非编码RNA的发现及其生物学功能多样性被揭示。

核酶的发现使得人们相信在生命的进化过程中曾经存在着一个活跃的RNA世界。

人们认识到RNA的研究在揭示生命本质和疾病防治方面都有着不可或缺的意义。

1982-1983年，ThomasCech和SidneyAltman等分别发现RNaseP的RNA亚基和嗜热四膜虫的前体rRNA中的居间序列（InterveningsequenceIVS）都具有酶的催化活性，它们是最早被发现的具有催化作用的RNA分子核酶（ribozyme），为RNA转录后加工机制提供了新的认识，并为生命起源的探讨开拓了新的境界。

1986年，WalterGilbert创造了“RNAworld”这个名词，用于描述其提出的关于分子起源的假说：

在生命进化的早期存在一个只有RNA，没有DNA和蛋白质的世界；RNA既是遗传信息载体又具有酶的催化功能，它们催化自身的合成。

“RNA世界”目录,TheRNAWorld（ThirdEdition,2006）RaymondF.GestelandThomasR.CechJohnF.AtkinsColdSpringHarborLaboratoryPress,一、起源于RNA与RNA起源,1.RNA的历史、化学、地理生物学2.对RNA世界起源认识的进展3.原始细胞：

包含遗传聚合体的膜囊泡,二、建立功能RNA,4.核糖开关与RNA世界5.自我切割核酸酶的催化策略：

RNA世界的遗迹？

6.I型内含子如何起作用：

RNA结构与功能的范例研究,三、退出古老的RNA世界合成酶与核糖体,7.RNA、脂质、膜8.氨基酰-tRNA合酶9.RNA在蛋白质合成中的作用10.从RNA世界进化而来的核糖体与蛋白质翻译,四、现代RNA世界中丰富的RNA角色,11.核糖核蛋白世界12.不断扩展的小核内核糖核蛋白世界13.剪接体结构与功能14.RNA分子位点特异性修饰的范例：

尿嘧啶插入、缺失RNA编辑15.端粒酶RNA16.形状多变的mRNA：

折叠的得与失,五、RNA继续战胜DNA,17.II型内含子：

一类剪接RNA并入侵DNA的核酶18.SINE和LINE：

麻烦制造者、破坏者、先行者19.短RNA生物学20.细菌内小RNA调控子的多能性21.参与哺乳动物基因剂量调控的长链非编码RNA,六、新兴工具,22.RNA二级结构预测23.一种用于全原子RNA建模的模块层次方法24.功能RNA序列的自动化体外筛选与芯片应用25.基于单分子方法的RNA折叠、展开、动力学研究,RNA有何基本特点与功能？

RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。

RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。

RNA比DNA小的多。

RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。

RNA的基本特点,RNA生物学功能,构成核糖核蛋白体小核内核糖核蛋白世界剪接体结构与功能RNA分子位点特异性修饰的范例：

尿嘧啶插入、缺失RNA编辑端粒酶RNA形状多变的mRNA：

折叠的得与失,RNA的种类、分布、功能,CrystalStructureoftheRibosomeat5.5ResolutionScience.2001.292:

883-896.MaratM.Yusupov,1*GulnaraZh.Yusupova,1*AlbionBaucom,1KateLieberman,1ThomasN.Earnest,2J.H.D.Cate,3HarryF.Noller11CenterforMolecularBiologyofRNA,SinsheimerLaboratories,UniversityofCaliforniaatSantaCruz,SantaCruz,CA95064,USA.2BerkeleyCenterforStructuralBiology,PhysicalBiosciencesDivision,LawrenceBerkeleyNationalLaboratory,Berkeley,CA94720,USA.3WhiteheadInstitute,Cambridge,MA01242,USA.,TheStructuralBasisofRibosomeActivityinPeptideBondSynthesisScience.2000.289:

920-930.PoulNissen,1*JeffreyHansen,1*NenadBan,1*PeterB.Moore,1,2ThomasA.Steitz1,2,31DepartmentofMolecularBiophysicsandBiochemistryand2DepartmentofChemistry,YaleUniversity,and3HowardHughesMedicalInstitute,NewHaven,CT06520-8114,USA.*Theseauthorscontributedequallytothiswork.,RNA组学,RNA组学研究全部非mRNA小RNA的集合,人类基因组序列特点：

2万2.5万个基因，与蛋白质合成有关的序列占整个基因组的2%左右，其余98%的基因组序列没有得到注释。

RNA组学研究范畴（小分子RNA）包括：

snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）,NoncodingRNAs（ncRNAs）ineukaryotesSmallRNA（sRNA）inbacteriaSmallnuclearRNAs（snRNAs）SmallnucleolarRNAs（snoRNAs）MicroRNA（miRNA）SmalltemporalRNAs（stRNAs）SmallinterferingRNAs（siRNAs）RNAinterference（RNAi）GuideRNAs（gRNAs）tRNA/mRNA:

tmRNA,非编码RNA的名称与缩写符号,RNA研究的进步与RNA技术的发展密切相关,RNA研究相关技术,RNA研究相关技术,RNA技术可以分为：

RNA基础研究相关的技术、RNA应用相关的技术、RNA生物信息学技术.RNA基础研究相关技术包括RNA分离纯化和鉴定技术、RNA与其他生物大分子相互作用技术、RNA高级结构的研究技术和其他相关RNA技术;RNA应用相关技术则包括用于生产其他产品的RNA技术和直接用于药物开发的RNA技术;RNA的生物信息学技术则有各种数据库、非编码RNA的预测、RNA二级结构预测和各种设计软件.,第一节RNA基础研究相关技术,RNA基础研究相关技术,大致可分为四类：

RNA分离纯化和鉴定技术、RNA与其他生物大分子相互作用技术、RNA高级结构的研究技术其他相关RNA技术。

RNA分离纯化和鉴定技术,RNA分离纯化和鉴定技术是几乎所有RNA基础研究的基点。

（1889年，Altmann第一次分离纯化出不含蛋白质的核酸制品。

1893年，Kossel提出，酵母来源的核酸含有核糖，RNA的研究正式开始。

）现在各种材料的RNA提取和纯化均包括三个步骤：

破碎细胞释放其内含物、非RNA物质的去除、RNA的浓缩。

Trizol的技术是目前应用最广泛和最著名的方法之一。

对于稀有样本还联合体外转录发展了总RNA扩增技术（cRNA扩增）。

RNA可利用体外转录体系合成,利用体外转录体系（invitrotranscriptionsystem）合成RNA是分子生物学常用技术。

这种体外转录体系是现代发展起来的体外转录（invitrotranscription）技术在含有RNA聚合酶（转录酶）、必要的蛋白质因子、核苷三磷酸等条件的体外无细胞体系中，加入DNA模板，模仿体内转录、生成RNA的过程。

利用真核细胞核抽提物（nuclearextract）建立再造体系是当前生物技术商家提供体外转录商品试剂盒（kit）的主要来源。

总RNA的分离纯化,总RNA的分离纯化技术已经相当完善，目前和将来的重要发展方向是RNA的进一步分级分离，其中小RNA的分离是研究的热点。

目前主要有两种：

一是利用电泳根据分子大小分离；二是利用不同浓度的有机溶剂的沉降或吸附效率不同分离。

Trizol技术,Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

特点：

1.Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作2.RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意配带手套，样品尽可能盖严3.细胞裂解必需充分且操作迅速。

裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。

细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。

在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA4.酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分5.2-8避光保存一年,准备工作,RNA酶（RNase）是导致RNA降解最主要的物质。

此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。

常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。

1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套2.RNase的又一污染源是取液器。

根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用以DEPC配制的乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理

（1）塑料制品：

尽量使用一次性无菌塑料制品。

已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理,处理的步骤如下：

在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%0.1%（DEPC-H2O）。

（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37或室温下处理过夜将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用,

（2）玻璃和金属物品250烘烤3小时以上DEPC（二乙基焦碳酸酯）DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理,实验步骤,1.取50100mg的组织,加入1mlTrizol试剂，用匀浆器打匀（Trizol先放于冰上）2.将匀浆室温放置5min3.加入200l氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min4.12000rpm，4离心15min5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400l），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。

（此步中注意：

不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。

）6.12000rpm，4离心15min7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失,8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700l乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。

（此时RNA是不溶解的）9.8000rpm，室温离心10min10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失11.真空离心干燥35分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉12.沉淀用30lDEPC-H2O溶解。

如发现沉淀难溶，68处理10min,13.RNA检测

（1）测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40g/mlRNA计算RNA的产量OD260/OD280在1.8-2.0

（2）进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况,RNA鉴定,RNA鉴定技术，主要是分析RNA的量、大小、丰度、定位、剪切、修饰和序列等信息纯化的RNA可通过光谱分析和定量分析特定RNA大小最常用的技术是Northern杂交技术，它是由Alwine等在1977年建立的,核酸定量（DNA或RNA的定量）A260=1.0相当于50g/ml双链DNA（dsDNA）40g/ml单链DNA（ssDNAorRNA）20g/ml寡核苷酸确定样品中核酸的纯度纯DNA:

A260/A280=1.8纯RNA:

A260/A280=2.0,核酸紫外吸收,衡量特异mRNA丰度方法,经典的衡量某一特异mRNA丰度的方法的有：

Northern杂交核糖核酸酶保护定量的反转录PCR等为研究异质细胞群中RNA和DNA序列的定位，还发展了原位杂交术目前这方面的技术发展方向是大规模化和高通量，其中基因芯片技术有着相当大的优势,RNA加工修饰鉴定技术,有关RNA加工修饰的鉴定技术有多种其中利用核酸酶对RNA进行作图，定位内含子和外显子；通过核提取物等进行体外剪切分析。

最近发展的基因芯片技术可以高通量地分析RNA剪接。

与RNA修饰和RNA编辑研究相关的技术主要有：

snoRNA指导的2-O-核糖甲基化修饰鉴定技术假尿苷化修饰鉴定技术mRNA的各种编辑鉴定技术等,另外，利用引物延伸法、S1核酸酶法等可以进行RNA末端鉴定。

近年来发展的CAGE（capanalysisgeneexpression），SAGE（serialanalysisofgeneexpression）等技术可以实现RNA末端大规模鉴定。

其基本原理是在RNA5端加上带酶切位点的接头，酶切后可产生带有5端序列的短片段，经过连接和测序，即可获得大量5Tag序列信息。

通过分析Taq的频率可同时估计基因的表达情况。

小RNA丰度测定,随着siRNA、microRNA、snoRNA等非编码RNA研究的不断深入，小RNA的分析和鉴定技术也逐步完善。

目前有关小RNA丰度测定主要是利用改进反转录PCR技术，常见有三种方案：

一、在两端加RNA接头二、通过在3端加polyA尾模拟mRNA三、利用stem-loop反转录引物技术,前两者同样可用于小RNA文库的构建，之后通过测序，可以获得小RNA的序列信息，在大规模实验的条件下，根据获得的克隆频数也能分析相应的表达水平。

也有一小部分小RNA序列是在生物信息学预测的结果基础上进一步验证获得的。

目前，高通量小RNA分析鉴定技术常用的是改进的非编码RNA芯片技术；对于特定的小RNA的分析鉴定除上述技术以外还有改良的Northern技术等。

克隆ncRNA的方法,计算机分析法基因克隆法蛋白质-RNA分离法,计算机分析法,大致过程：

利用计算机软件从已知基因组序列中寻找基因间区中的snoRNA序列，然后模拟其高级结构，设计引物扩增其序列和克隆，或人工合成其序列，测定其功能。

小RNA的克隆和鉴定,详见：

http:

/exppc01.uni-muenster.de/expath/snmrnas.htm,蛋白质-RNA复合物分离法,分离蛋白质-RNA复合物，除去蛋白质，纯化RNA分子，反转录成cDNA，克隆，测序，结果分析。

所得RNA的cDNA克隆必须进行Northern杂交，以确认其转录物大小是否相符。

RNA与其他大分子相互作用研究技术,RNA与蛋白相互作用在基因表达调控中发挥着重要作用，相应的技术也与细胞技术和蛋白质技术交叉。

通过光交联进行RNA的体外修饰并增加RNP的稳定性，利用凝胶阻滞和硝酸纤维素滤膜结合实验技术分析RNA-蛋白质作用常数，用免疫共沉淀技术分离特异的RNP。

RNA足迹、修饰干扰分析和RNP中寡核苷酸靶向的RNaseH切割保护实验技术也常用于鉴定重要的蛋白质结合位点。

目前这方面研究也有向大规模发展的趋势，主要有两种方案：

一是在细胞水平利