分子生物学复习提纲答案.docx

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分子生物学复习提纲答案

分子生物学复习提纲答案

分子生物学复习提纲（个人答案，仅供参考）

名词解释

1.同源染色体：

二倍体细胞中染色体以成对的方式存在,一条来自父本，一条来自母本，且形态、大小相同，并在减数分裂前期相互配对的染色体。

含相似的遗传信息。

2.限制性片段长度多态性：

用限制酶切割来源不同的DNA，可以得到不同长度的DNA片段，称为限制性片段。

当用特别的探针与这些DNA片段杂交时，发现同一物种不同个体DNA的杂交信号有所不同，这种技术就是限制性片段长度多态性技术。

3.表达序列标记（EST）：

从cDNA文库随机取样进行测序，在基因组中定位，作为表达基因的位标。

这样的位标称为表达序列标记。

转录图谱就是以EST作为位标的基因组图，又称cDNA图或表达序列图。

4.引物：

DNA聚合酶不能从无到有地合成DNA链，只能把脱氧核苷酸连接在已有核酸的3’-羟基上，而且该核酸的序列必须与DNA模板的3’端序列互补，并形成结合，这已有的核酸就是引物。

5.核酸分子杂交：

异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。

可分为液相杂交和固相杂交两种。

6.限制性内切酶：

是一种内切核酸酶，由细菌产生，能识别双链DNA的特定序列（限制位点），并水解该序列内部或附近的磷酸二酯键。

可分为三类：

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型限制酶，其中Ⅱ型限制位点和切割位点都确定。

7.探针：

是指用以与待测核酸进行杂交的已知序列的标记核酸片段。

8.细胞周期：

是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。

细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂开始的时间叫细胞分裂间期。

9.Southernblotting：

即DNA印迹法，将通过凝胶电泳分离的待测核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针进行杂交并分析。

10.Westernblotting：

即蛋白质印迹法，它和DNA印迹法、RNA印迹法类似，由电泳分离、转移固定和检测分析等组成。

用它既可以鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，也可以检测一种目的蛋白在不同组织细胞内的相对含量。

11.单基因疾病：

是由单一基因突变引起的疾病，属于孟德尔遗传病，常见病有血友病A和假肥大型肌营养不良症。

12.原癌基因：

又称细胞癌基因，是存在于细胞基因组中的一种正常基因，其功能是控制细胞生长和分化。

原癌基因是病毒癌基因的同源序列。

原癌基因受物理、化学或微生物等因素的作用，发生突变或扩增等，激活成为癌基因。

13.癌基因：

是原癌基因的突变体，其编码产物可以使培养细胞发生转化，或在动物体内诱发肿瘤。

14.抑癌基因：

是一类存在于正常细胞内、调控细胞生长的基因，具有潜在抑癌作用。

如果这类基因发生突变而失活，可以引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。

15.基因芯片技术：

将大量寡核苷酸分子作为探针，固定于较小的支持物表面，然后与标记好的待测核酸样品进行杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样品中待测核酸的数量或活性状态。

问答题

一、简述PCR引物设计原则

1）引物长度合适——不小于15nt，一般为15~30nt。

2）引物碱基的组成和分布具有随机性——要避免嘌呤或嘧啶碱基含量过高或集中排列。

3）引物的碱基组成基本一致——碱基组成影响退火温度，两个引物的碱基组成一致，可以应用相同的退火温度，确保PCR的成功。

4）引物内部避免形成二级结构——不超过3bp。

5）引物之间没有互补性——会造成引物之间退火，发生引物扩增，降低扩增效率。

6）引物的3’端最好是G/C

7）引物的5’端可以修饰——即使不互补，也基本不影响PCR的特异性。

8）引物严格特异

9）引物的浓度合适

10）引物的质量好

印迹杂交过程：

样品制备—电泳分离—印迹—预杂交—杂交—洗膜—分析

二、试述DNA印迹法的原理、操作过程及其应用

原理：

将通过凝胶电泳分离的待测核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针进行杂交并分析。

过程：

1、提取DNA、用限制酶切割，获得DNA片段混合物。

2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段

3、用碱处理电泳凝胶，将DNA片段原位变性解链。

4、将变性的DNA片段从凝胶转移到固相膜上。

5、用封闭物预杂交，然后漂洗除去未结合封闭物。

6、用探针杂交液浸泡固相膜，与待测DNA片段进行杂交。

7、用不同离子强度的溶液依次漂洗固相膜，除去未杂交探针和形成非特异性杂交体的探针。

8、通过显影或显色分析固相膜上的杂交体，将杂交体位置和凝胶电泳图谱进行对比，可计算待测DNA片段的分子量。

应用：

检出特异的DNA片段，测定分子量，分析DNA限制酶图谱、DNA指纹、基因突变、基因扩增和DNA多态性等。

三、根据被测定的对象，简述分子杂交印迹的种类、特点及其应用上优缺点

1、DNA印迹法

2、RNA印迹法

●RNase无处不在，要绝对消除外源RNase的污染。

●先变性后电泳、转移。

●不能采用碱变性，只能采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性。

●可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一种特异RNA，特别是分析mRNA的长度和含量。

3、蛋白质印迹法

●也是由电泳分离、转移固定和检测分析等组成。

●只能用电转移法进行转移。

●用抗原-抗体反应检测目的蛋白

四、原癌基因是如何被激活的

1、点突变——某一个核苷酸发生改变——蛋白质一级结构改变——功能异常——癌变。

2、基因扩增——基因拷贝数的增加。

原癌基因的扩增如果在不恰当的阶段发生，会造成持续性高水平表达，导致其表达产物癌蛋白的增加，从而引起细胞的功能紊乱。

3、基因重排——染色体易位——使无活性或低活性的原癌基因转移到某些强启动子或增强子附近而激活，从而使原癌基因表达产物显著增加，导致肿瘤的发生。

4、插入突变——在原癌基因附近插入某种DNA序列，从而引起基因表达改变。

5、DNA去甲基化——DNA的甲基化程度对于保持双螺旋结构的稳定性、阻抑基因表达具有重要作用。

甲基化程度越低，肿瘤恶性程度和转移能力就越高，临床分期也越晚。

五、试述人类基因组计划的主要内容及意义

1、内容：

研究人类基因组，主要目标是绘制人类基因组的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱，并在此基础上进行基因定位和分离，建立人类遗传物质的全套信息数据库，破解人类的全部遗传信息。

2、意义：

人类基因组序列图谱的完成宣告了“功能基因组时代”的到来。

功能基因组学研究基因结构，阐明所有基因产物的功能，研究基因表达的调控机制并绘制基因表达调控的网络图，在基因组水平上揭示生命的起源和进化。

人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。

对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。

对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。

健康相关研究是HGP的重要组成部分，1997年相继提出：

“肿瘤基因组解剖计划”“环境基因组学计划”。

六、试述研究蛋白质组学的方法及意义

1、方法：

以蛋白质组为研究对象，从整体、动态和网络水平上对蛋白质进行研究。

2、意义：

●蛋白质组研究是寻找疾病分子标记最有效的方法。

●为探索肿瘤、老年痴呆症等疾病的发生机制提供了新的方法。

●对病原微生物进行蛋白质组学分析，寻找致病因子并研制疫苗。

●推动新药的开发。

●蛋白质组研究不仅可以实现与基因组的衔接和确认，解读“基因组”天书，直接揭示生命活动的规律和本质；更可以研究人类重大疾患或病原体致病的物质基础以及发生和发展的病理机制。

七、试从细胞周期调控的角度论述肿瘤的发生

在正常情况下，高等动物细胞只有在受到生长因子的刺激时才发生分裂，这些生长因子是由其它细胞分泌的。

肿瘤细胞恶性增生的一个重要原因是某些基因发生突变，导致细胞不需生长因子刺激就发生分裂，不再受正常的细胞增殖调控系统约束。

这些基因的正常表达产物大都为信号转导蛋白，通过信号转导途径调控细胞的生长、分化和凋亡。

这些基因的表达一旦出现异常，就会使生长信号的转导失控，最终导致细胞转化或癌变。

许多实验表明：

在多种肿瘤中均有Cyclin单独或与其相应的CDK共同过表达或基因扩增，这些并不受细胞周期调节而持续存在。

肿瘤组织中CyclinA表达显著高于非肿瘤组织。

在人类乳腺癌细胞株中发现了CyclinB1启动子活性增高，及其在G1期有非时相的功能活性。

75％的肿瘤细胞系有P16基因纯合性缺失和突变，在肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌中有较高频率的P16基因表达异常；大多数肿瘤中未发现p21突变，但存在多态性改变，使表达减弱。

八、试述细胞凋亡调控的分子机制

1、bcl-2基因：

可以抑制细胞凋亡，特别是抑制生发中心的B细胞凋亡。

Bcl-2可以抑制由许多因素引起的细胞凋亡，如血清和生长因子的缺乏、膜脂质过氧化反应和Ca+通道激活剂、射线、化学药物的作用等。

此外，Bcl-2能抑制p53诱导的细胞凋亡，并与Myc共同作用，抑制细胞凋亡，使细胞持续增生。

2、p53：

当DNA的损伤比较严重，超过了细胞的自我修复能力时，激活的p53通过诱导bax基因表达、抑制bcl-2基因表达等途径诱导细胞凋亡，清除损伤细胞，以保持正常的器官功能。

3、凋亡抑制蛋白（IAP）家族：

主要通过两个途径抑制细胞凋亡：

一是直接抑制Caspases的活化；二是与TNF受体相关因子结合，激活NF-kB，使细胞表达生存必需的基因。

4、病毒蛋白：

许多病毒及其基因产物对宿主细胞凋亡具有重要的调节作用，一方面一些病毒在感染期间能够诱发细胞凋亡；另一方面一些病毒进化出抑制被感染细胞凋亡的机制，加速和维持感染，以产生更大量的子代病毒，如腺病毒编码的E1A蛋白既能激活静止期细胞进入细胞增殖期，又能在增殖受阻时促进细胞凋亡。

而E1A的表达受p53的调控，同时E1A诱导的P53介导的细胞凋亡可被腺病毒E1B蛋白抑制。

九、原癌基因、癌基因、抑癌基因与细胞周期、细胞凋亡调控基因的关系

1）原癌基因：

1、ras基因——一些生长因子如EGF和胰岛素可通过RTK（蛋白酪氨酸激酶受体）激活Ras蛋白，另一些生长因子如IL-2、3、5的受体无蛋白酪氨酸激酶活性，则通过激活PTK（细胞质基质蛋白酪氨酸激酶）而激活Ras蛋白。

激活的Ras蛋白通过激活Raf和PI-3K途径调控细胞增殖和凋亡。

2、myc——Myc蛋白的N端含转录激活域。

Myc蛋白参与正常细胞增殖、转化和分化的调控。

高水平的Myc蛋白可以加速细胞生长。

3、bcl-2

一些原癌基因产物就是Cyclin

一些原癌基因产物诱导Cyclin表达

一些原癌基因产物调节CDK活性

一些原癌基因产物是Cyclin，CDK底物

2）癌基因：

3）抑癌基因：

1、Rb——在G1期，Rb蛋白是细胞周期抑制信号的集合点，低磷酸化的Rb蛋白阻止细胞G1/S期和G2/M期的过渡，从而抑制细胞分裂增殖。

Rb蛋白通过对转录因子E2F的作用来调控细胞增殖和分化。

2、p53——野生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖过程中起重要作用。

促进DNA修复。

3、p16蛋白既是细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子。

抑制CDK4，使Rb蛋白保持低磷酸化，抑制细胞从G1期向S期的过渡，从而抑制细胞增殖。

4、nm23

作为CDKI：

p15、p16、p21和p27

通过CDKI抑制细胞周期：

p53，Rb

十、基因治疗的主要策略、基本过程及存在的问题

1、策略：

✧基因修复——即基因矫正，是指通过矫正突变碱基来修复致病基因。

✧基因置换——以正常基因取代致病基因。

✧基因增补——将目的基因导入异常细胞，其表达产物能补偿致病基因的功能。

✧基因干预——反义核酸技术、核酶技术、RNA干扰技术、自杀基因技术。

✧免疫基因治疗——把产生抗病毒或抗肿瘤免疫应答的基因导入体内，改变机体免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。

✧耐药基因治疗

✧基因激活——重新开放已经关闭的基因。

2、基本过程：

Ø目的基因的选择和制备

Ø靶细胞的选择

Ø基因的导入——体内法、原位法、回输法。

基因导入需要载体，有病毒载体法和非病毒载体法两种。

Ø转染细胞的筛选和导入基因的鉴定

3、存在问题：

●需要更多的切实有效的目的基因

●需要提高基因导入效率

●需要提高基因导入的特异性

●需要提高目的基因表达的可控性

PPT

细胞凋亡的特征:

1、胞质浓缩、染色质凝集、染色体降解呈DNAladder、细胞膜出芽形成凋亡小体。

2、体内被正常细胞或吞噬细胞清除，而不引发炎症。

细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别

细胞凋亡：

一般都要经过诱导-调控与执行-效应3个阶段

1、单细胞丢失

2、细胞膜发泡但仍完整

3、细胞膜内陷将细胞分割成多个有膜包裹、

内涵物不外溢的凋亡小体

4、不发生炎症反应

5、被临近正常细胞或吞噬细胞吞噬

6、溶酶体完整

7、染色质均一凝集

细胞坏死：

1、细胞成群丢失

2、细胞膜不完整

3、细胞肿胀、溶解

4、发生严重炎症反应

5、被巨噬细胞吞噬

6、溶酶体裂解

7、染色质凝集成块、不均一

细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别

细胞凋亡：

1、生理因素或非生理因素诱导

2、受大分子合成和激活过程的严格调控

3、需要能量

4、需要大分子合成

5、有新基因从头转录

6、染色质非随机降解为DNA“梯带”

细胞坏死：

1、非生理因素造成的意外损伤

2、离子稳态调节丧失

3、不需要能量

4、不需要核酸和蛋白质的合成

5、没有新基因转录

6、染色质DNA随机降解为涂抹状

由于生化改变是从基因开始，从内到外，所以DNA的损伤发生在胞质、胞膜通透性改变之前即凋亡早期，而坏死由于损伤是从外到内，细胞器溶酶体等先溶解、破裂，释放的酶再把DNA随机降解成无数大小不一的片段，电泳呈涂沫状拖带，不能形成“梯子”

减数分裂

如果是生殖细胞，则进行减数分裂:

第1次分裂，只是同源染色体（人类共有23对）分开，分别进入两个子细胞而姊妹染色单体不分开，即新合成的两条子代DNA还不分开。

第2次分裂，两条子代DNA随着姊妹染色单体分开，分别进入两个子细胞中，因此生殖细胞的减数分裂，染色体DNA复制一次，细胞分裂2次，形成4个单倍体细胞，每个配子细胞只有23条染色质即23条DNA双链。

主要检验点：

包括G1/S检验点，S期检验点，G2/M检验点，纺锤体组装检验点（SAC）。

cDNA文库：

以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNAlibrary）

基因工程常用工具酶：

限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA

连接酶催化5'-磷酸与3'-羟基形成磷酸二酯键

DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA

RNA聚合酶以RNA为模板合成DNA

碱性磷酸酶切除末端磷酸

T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化

末端脱氧核苷酸转移酶催化3'-端合成同聚体尾

常用载体：

质粒（plasmid）；

噬菌体（phage）；

酵母载体（yeastvector）；

病毒载体（virusvector）。

印迹（转膜）方法：

毛细管虹吸转移法

真空转移法

电转移法

单基因遗传性高血压

1）糖皮质激素可矫正的醛固酮增多症

特点：

高醛固酮、低肾素、盐敏感

病因：

醛固酮合成酶基因突变，与-11-羟化酶融合，调控区为-11-羟化酶基因的调控区，表达异常高，且不受肾素、血管紧张素调节，只受促肾上腺皮质激素ACTH的调节，ACTH受糖皮质激素抑制。

2）盐皮质激素增多症

特点：

低醛固酮、低肾素、盐敏感

病因：

-11-羟固醇脱氢酶Ⅱ基因表达异常，皮质醇不能转化为皮质酮，皮质醇增加，激活盐皮质激素受体