106成品纯度RPHPLC分析方法验证方案0723.docx

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106成品纯度RPHPLC分析方法验证方案0723

起草人/日期Preparedby/Date：

审核人

部门

日期

批准人/日期Approvedby/Date：

一、目的：

1.证明该方法适用注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度的测定。

2.验证注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度测定的RP-HPLC方法的可靠性和有效性。

二、范围：

1.适用于注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度测定的RP-HPLC分析方法验证。

三、责任：

部门

职责

QC

负责方法验证方案的起草，验证有关的培训，分析仪器的操作及原始数据的记录，起草验证报告。

QC经理负责方法验证方案和报告的审核，协调指导该项验证工作。

QA

负责审核验证方案和验证报告，组织开展验证工作，协调验证实施。

QA经理负责方法验证方案、报告的审核。

负责验证文件的保存归档。

质量管理负责人负责方法验证方案和报告的批准。

四、分析方法描述：

1.仪器和色谱柱

1.1HPLC泵：

二元或二元以上梯度洗脱泵

1.2HPLC检测器：

UV检测器或二极管阵列检测器。

1.3色谱柱：

C4，4.6×250mm，孔径300Å或相同规格的色谱柱

1.4操作条件

1.4.1流动相：

A：

0.1%TFA的水溶液

B：

0.08%TFA的乙腈溶液

1.4.2流速：

0.7mL/min

1.4.3检测波长：

280nm

1.4.4柱温：

40±2℃

1.4.5样品温度：

4±2℃

1.4.7上样量：

1mg/ml，20L

1.4.8按下表进行梯度洗脱，必要时调整流动相比例，使主峰保留时间约为16分钟，主峰前后的相关蛋白与之分离度不小于1.5。

No.

Time/min

A（%）

B（%）

1

0

70

30

2

3

70

30

3

20

55

45

4

25

50

50

5

26

0

100

6

30

0

100

7

31

70

30

8

41

70

30

1.5结果计算

按峰面积归一法计算，主峰及其相关蛋白峰面积应不低于总面积的98%，主峰面积应不低于95%。

五、方案培训：

1.验证开始前首先由起草人对相关人员进行方案培训，按照培训管理规程的规定进行记录，并将培训记录的复印件纳入验证报告的附件。

六、验证内容：

1.相关确认

1.1仪器确认：

确认相关仪器、设备经过校验，在校验合格期内。

记录表格见附件一表1。

1.2色谱柱确认

确认色谱柱的规格，序列号。

记录表格间附件一表2。

1.2试剂、标准品和样品确认

确认所用试剂、标准品和样品规格和纯度符合要求，在有效期内。

记录表格见附件一表3，4。

1.3人员培训确认：

确认操作人员接受了高效液相色谱仪方法操作培训。

2.验证程序

项目包括：

系统适用性、专属性、检测限、精密度和溶液稳定性。

2.1系统适用性

2.1.1目的

测定该分析方法的系统适用性。

2.1.2溶液配制

2.1.2.1空白溶液：

超纯水

2.1.2.2辅料溶液：

称取柠檬酸三钠二水合物220.0mg，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物20.0mg，氯化钠818.0mg，聚山梨酯800.105g，加超纯水90ml溶解，用柠檬酸调节pH至6.5±0.5，再加超纯水定容至100ml。

参照系统适用性溶液配制的稀释倍数对上配制的辅料再进行稀释，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.1.2.3系统适用性溶液：

取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml中含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.1.3方法

精密量取空白溶液，辅料溶液和系统适用性溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录保留时间、分离度。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

2.1.4可接受标准

主峰与相邻杂质分离度大于1.5，。

2.1.5记录表格样式，见附件二

2.2专属性实验

2.2.1目的

证明该方法在辅料，杂质，降解产物等存在下，能正确测定出被测物。

2.2.2溶液配制

2.2.2.1空白溶液：

超纯水

2.2.2.2辅料溶液：

称取柠檬酸三钠二水合物220.0mg，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物20.0mg，氯化钠818.0mg，聚山梨酯800.105g，加超纯水90ml溶解，用柠檬酸调节pH至6.5±0.5，再加超纯水水定容至100ml。

参照样品溶液配制的稀释倍数对上配制的辅料再进行稀释，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.2.2.3样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml中含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.2.2.4理化对照品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品适量，用超纯水稀释至每1ml中含蛋白1mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.2.3方法

2.2.4可接受标准

2.2.5记录表格样式，见附件三

2.3检测限（LOD）

2.3.1目的

测定该分析方法的杂质检测限。

2.3.2溶液配制

2.3.2.1空白溶液：

超纯水

2.3.2.2检测限溶液：

取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1mg的溶液，10000r/min离心6min，取上清，然后逐步稀释至最小杂质信噪比为2~3。

2.3.3方法

精密量取检测限溶液，由高浓度到低浓度各20μl注入液相色谱仪，计算最小杂质的信噪比，最小杂质的信噪比为2~3时，该浓度即为最小杂质检测限对应溶液浓度。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

2.3.4可接受标准

LOD对应的最小杂质的信噪比为2~3。

2.3.5记录表格样式，见附件四

2.4精密度

2.4.1目的

测定该分析方法下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

2.4.2溶液配制

2.4.2.1空白溶液：

超纯水

2.4.2.2样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.4.3方法

2.4.3.1重复性

精密量取样品溶液20μl注入液相色谱仪，由一名分析员重复进样6次，记录主峰面积和保留时间，计算主峰峰面积和保留时间的相对标准偏差。

将记录和原始图谱纳入验证报告。

2.4.3.2中间精密度

由两分析员用同种方法新鲜配制样品溶液，每天一人，连续三天按照空白溶液1针、样品溶液连续6针的顺序进行进样，进样量20μl。

记录主峰的峰面积和保留时间，计算6针样品的主峰平均峰面积和平均保留时间，根据3天的平均值计算相对标准偏差。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

2.4.3可接受标准

可接受标准为峰面积的RSD不大于2.0%，保留时间的RSD不大于1.0%。

2.4.5记录表格样式，见附件五

2.5耐用性

2.5.1目的

考察测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的程度。

2.5.2溶液稳定性

2.5.2.1溶液配制

2.5.2.1.1空白溶液：

超纯水

2.5.2.1.2样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.5.2.2方法

样品溶液保存在4℃，精密量取20μl样品溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h进样，记录样品纯度。

2.5.3色谱柱耐用性

2.5.3.1溶液配制

2.5.3.1.1空白溶液：

超纯水

2.5.3.1.2样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.5.3.2方法

取两根相同型号，规格，不同批号的色谱柱，精密量取20μl样品溶液，注入色谱仪，每根色谱柱重复测定3次，计录主峰的纯度和保留时间，计算3针样品的主峰平均纯度和平均保留时间，根据两色谱柱测定的主峰平均纯度和平均保留时间平均值计算相对标准偏差。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

2.5.4可接受标准

2.5.4.1溶液稳定性

样品溶液在规定时间内样品纯度的RSD不大于2.0%。

2.5.4.2色谱柱耐用性

主峰纯度的相对平均偏差不大于2.0%，主峰保留时间的相对平均偏差不大于1.0%。

2.5.5记录表格样式，见附件六

十、缩写与定义：

MV是MethodValidation（方法验证）的缩写。

LOD是LimitofDetection（检测限）的缩写。

十一、参考文件：

1.现行版中国药典二部附录XIXA药品质量标准分析方法验证指导原则

2.美国FDA分析方法验证指南

3.ICH.ValidationofAnalyticalProcedures:

TextandMethodology.Q2（R1）.

4.生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则

十二、附件：

1.相关确认记录MV-12-009A1

2.系统适用性记录MV-12-009A2

3.专属性记录MV-12-009A3

4.检测限记录MV-12-009A4

5.精密度记录MV-12-009A5

6.耐用性记录MV-12-009A6

表1：

仪器确认表

仪器名称

厂家

型号

编号

校验有效期至

HPLC

移液器（100-1000μl）

移液器（10-100μl）

移液器（2-20μl）

水浴锅

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

表2：

色谱柱确认表

厂家

规格

SN

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

表3：

试剂确认表

试剂名称

规格

批号

有效期至

三氟乙酸

乙腈

柠檬酸三钠二水合物

氯化钠

乙二胺四乙酸二钠二水合物

聚山梨酯-80

无水柠檬酸

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

表4：

标准品或样品确认表

样品名称

规格

批号

来源

注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品

注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

系统适用性

1样品制备

1.1空白溶液：

超纯水

1.2辅料溶液：

称取柠檬酸三钠二水合物g，氯化钠g，乙二胺四乙酸二钠二水合物g，聚山梨酯-80g，加超纯水ml溶解，用柠檬酸调节pH至，再加超纯水水定容至ml。

再精密量取上述溶液μl，加超纯水

μl混匀，10000r/min离心6min，取上清。

1.3样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，稀释成1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2方法

精密量取空白溶液，辅料溶液和样品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录主峰保留时间，分离度。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

色谱峰

保留时间

分离度

1

2

3

4

5

6

可接受标准：

主峰相邻杂质与其分离度>1.5

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

专属性

1样品制备

1.1空白溶液：

超纯水

1.2辅料溶液：

称取柠檬酸三钠二水合物g，氯化钠g，乙二胺四乙酸二钠二水合物g，聚山梨酯80g，加超纯水ml溶解，用柠檬酸调节pH至，再加超纯水水定容至ml。

在精密量取上述溶液μl，加超纯水

μl混匀，10000r/min离心6min，取上清。

1.3样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，稀释制成含蛋白1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

1.4理化对照品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品

μl，加超纯水μl，稀释制成含蛋白1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

看样品主峰与理化对照品保留时间是否一致，空白溶液、辅料，杂质和主峰间是否有干扰。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

样品与理化对照品主峰保留时间（min）

样品：

理化对照品：

样品纯度，杂质和主峰间分离度

样品：

可接受标准：

样品主峰与理化对照品保留时间一致，空白溶液，辅料无干扰，杂质，降解产物等和主峰间无干扰

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

检测限（LOD）

1样品制备

1.1空白溶液：

超纯水

1.2检测限溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，稀释制成含蛋白1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清，逐步稀释至最小杂质信噪比为2~3。

2方法

精密量取检测限溶液，由高浓度到低浓度各20μl注入液相色谱仪，计算最小杂质的信噪比。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

溶液

浓度（mg/ml）

信噪比（S/N）

1

2

3

4

5

6

可接受标准：

最小杂质的信噪比为2~3

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

精密度

1样品制备

1.1空白溶液：

超纯水

1.2样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，用超纯水稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2方法

2.1重复性

精密量取样品溶液20μl注入液相色谱仪，重复进样6次，记录主峰面积和保留时间，计算主峰峰面积和保留时间的相对标准偏差。

将记录和原始图谱纳入验证报告。

进样次数

保留时间（min）

主峰面积

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD

可接受标准：

RSD≤1.0%

RSD≤2.0%

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

2.2中间精密度

由两分析员用同种方法新鲜配制样品溶液，每天一人，连续三天精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

按照空白溶液1针、样品溶液连续6针的顺序进行进样，进样量为20μl。

计录主峰的峰面积和保留时间，计算6针样品的主峰平均峰面积和平均保留时间，根据3天的平均值计算相对标准偏差。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

分析员1：

分析员2：

天数

次数

主峰面积

保留时间（min）

1（分析员1）

2（分析员2）

3（分析员1）

1（分析员1）

2（分析员2）

3（分析员1）

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD

接受标准

RSD≤2.0%

RSD≤1.0%

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

耐用性

1溶液稳定性

1.1溶液配制

1.1.1空白溶液：

超纯水

1.1.2样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

1.2方法

样品溶液保存在4℃，精密量取20μl样品溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h进样，记录样品纯度。

将记录和原始图谱纳入验证报告。

时间

纯度

0h

2h

4h

8h

12h

纯度

平均值

RSD

可接受标准

RSD≤2.0%

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：

2色谱柱耐用性

2.1溶液配制

2.1.1空白溶液：

超纯水

2.1.2样品溶液：

精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品μl，加超纯水μl，稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。

2.2方法

取两根相同型号、规格，不同批号的色谱柱，精密量取20μl样品溶液，注入色谱仪，每根色谱柱重复测定3次，计录主峰的纯度和保留时间，计算3针样品的主峰平均纯度和平均保留时间，根据两色谱柱测定的主峰平均纯度和平均保留时间平均值计算相对平均偏差。

将记录表格和原始图谱纳入验证报告。

色谱柱1SN：

色谱柱2SN：

检测项目

纯度（%）

保留时间（min）

色谱柱

1

2

1

2

进样次数

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

结果

平均值

相对平均偏差

可接受标准

相对平均偏差≤2.0%

相对平均偏差≤1.0%

结论：

备注：

执行人/日期：

复核人/日期：