等电点聚焦测蛋白质等电点.doc

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实验四等电点聚焦测蛋白质等电点

宫魁六组200928006841083

一、实验原理：

等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。

聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。

一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。

二、实验仪器和用具：

玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪

三、试剂：

0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等

四、实验步骤：

1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；

2、配胶：

丙烯酰胺储液0、67ml

两性载体电解质0、2ml

TEMED0、004ml

牛血清蛋白质样品0、04ml

蒸馏水2.9ml

过硫酸铵0.02ml

3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；

4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；

5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；

6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；

7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；

8、量取三条胶的长度；

9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；

10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。

将所得pH值对凝胶长度作图，得标准曲线；

11、样品的pH值测定测定出染色蛋白带的位置，在pH梯度曲线上求出相应pH值即是此样品的pI。

五、结果

1、凝胶条的长度及染色蛋白带的位置

凝胶条编号

1

2

3

长度

9.8cm

9.6cm

9.8cm

蛋白带距酸端距离

3.2cm

3.2cm

未染色，测梯度

①染色后凝胶条的长度稍微变长，其变长长度不计；

②由凝胶条1和2及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距离比率：

（3.2/9.8+3.2/9.6）/2=0.33

③凝胶条3蛋白带距酸端的距离应为：

9.8cm*0.33=3.23cm

2、pH梯度表及其相应标准曲线

标号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

长度

1cm

1cm

1cm

1cm

1cm

1cm

1cm

1cm

1cm

0.8cm

PH值

2.98

3.32

3.52

5.11

7.00

7.79

8.35

8.84

9.21

9.55

得出其标准公式为：

y=0.844x+1.9421

3、实验结果：

待测蛋白质的等电点为0.844*3.23+1.9421=4.67