模型及实验仪器耗材DOC.docx

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模型及实验仪器耗材DOC

ELISA法检测大鼠血清中FSH、LH、E2、T水平

1.1实验药品试剂

生理盐水，批号：

20130116，山东康宁药业有限公司；

无水乙醇，批号：

32061，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

水合氯醛，批号：

30037517，上海国药集团化学试剂有限公司；

FSHELISA试剂盒，武汉俊泰生物技术有限公司，批号：

E11122904

LHELISA试剂盒，武汉俊泰生物技术有限公司，批号：

E11100806

E2ELISA试剂盒，武汉俊泰生物技术有限公司，批号：

E11100804、

TELISA试剂盒，武汉俊泰生物技术有限公司，批号：

E11100802

1.2实验仪器

EP管，型号：

1.5ml，美国Axygen公司；

玻璃匀浆器，型号：

1ml，武汉科瑞生物技术有限公司；

移液器，型号：

0.1-2.5μL，0.5-l0μL，20-200μL，100-1000μL，美国Thermo公司；

电子天平，型号：

PL203，上海梅特勒——托利多仪器有限公司；

高压蒸汽灭菌锅，型号：

YXQ-LS-75G，常州诺基仪器有限公司；

全自动干燥箱，型号：

DHG-9640C，杭州蓝天公司；

超低温冰箱，型号：

T11-86-340-LA，北京天地精仪科技有限公司；

低温高速离心机，型号：

CR21GⅡ，日本日立公司；

多功能酶标仪，型号：

spectraMAXM5，上海美谷分子仪器有限公司；

Real-TimePCR、WesternBolt检测TGF-β1受体蛋白表达水平

1.实验药品试剂

PCR所用实验用品：

生理盐水，批号：

20130116，山东康宁药业有限公司；

无水乙醇，批号：

32061，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

水合氯醛，批号：

30037517，上海国药集团化学试剂有限公司；

DEPC，武汉科瑞生物技术有限公司；

TRIzol，批号：

15596-026，美国Lifetechnologies公司；

氯仿，批号：

100068608，上海国药集团化学试剂有限公司；

异丙醇，批号：

32064，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

逆转录试剂盒，批号：

RR047A，宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKaRa公司）；

SYBRPremixExTaq[TM]，批号：

RR420A，宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKaRa公司）；

Westernbolt所用实验用品：

生理盐水，批号：

20130116，山东康宁药业有限公司；

无水乙醇，批号：

32061，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

水合氯醛，批号：

30037517，上海国药集团化学试剂有限公司；

脱脂奶粉，武汉科瑞生物技术有限公司；

Tween-20，武汉科瑞生物技术有限公司；

考马斯亮蓝快速染色液，武汉科瑞生物技术有限公司；

丽春红染液，武汉科瑞生物技术有限公司；

氯化钠，批号：

1266-2006，天津恒兴化学试剂制造有限公司

Glycine，武汉科瑞生物技术有限公司；

TrisBase，武汉科瑞生物技术有限公司；

SDS，武汉科瑞生物技术有限公司；

二甲苯，批号：

10023428，上海国药集团化学试剂有限公司；

HCl，批号：

81013，中国平煤神马集团开封东大化工有限公司；

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，批号：

P0012A，上海碧云天生物技术有限公司；

TEMED，批号：

ST728，上海碧云天生物技术有限公司；

Western一抗二抗去除液（强碱性），批号：

P0025，上海碧云天生物技术有限公司；

WesternBlot超敏发光液，批号：

P1010，北京普利莱基因技术有限公司；

RIPA裂解液，批号：

P0013，上海碧云天生物技术有限公司；

PMSF，批号：

329-98-6，北京中生瑞泰科技有限公司；

BCA试剂盒，批号：

P0010S，上海碧云天生物技术有限公司；

Prestainedproteinloadingbuffer，批号：

26617，美国Thermo公司；

PrestainedproteinMWmarker，批号：

26616，美国Thermo公司；

5×Loadingbuffer，武汉科瑞生物技术有限公司；

硝酸纤维素膜，批号：

T328591，美国Lifetechnologies公司；

一抗：

GAPDH抗体；TGF-β1抗体美国millipore公司）

二抗：

羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗，鼠抗羊二抗（武汉科瑞生物技术有限公司）；

大鼠β-actin引物、TGF-β1引物。

英潍捷基（上海）贸易有限公司合成并经质量检测。

引物序列见表1。

表1引物序列

目的基因

引物序列

产物长度

β-actin

Forward：

5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′

171bp

Reverse：

5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′

TGF-β1

Forward：

5′-CAGACTCATGATGACAGAGG-3′

381bp

Reverse：

5′-GAGATGTACAGGATCTTCCC-3′

1.3实验仪器

PCR所需仪器

EP管，型号：

1.5ml，美国Axygen公司；

玻璃匀浆器，型号：

1ml，武汉科瑞生物技术有限公司；

移液器，型号：

0.1-2.5μL，0.5-l0μL，20-200μL，100-1000μL，美国Thermo公司；

去酶PCR管，型号：

0.2ml，美国Axygen公司；

八联管、盖，型号：

0.2ml，美国Axygen公司；

电子天平，型号：

PL203，上海梅特勒——托利多仪器有限公司；

高压蒸汽灭菌锅，型号：

YXQ-LS-75G，常州诺基仪器有限公司；

全自动干燥箱，型号：

DHG-9640C，杭州蓝天公司；

超低温冰箱，型号：

T11-86-340-LA，北京天地精仪科技有限公司；

低温高速离心机，型号：

CR21GⅡ，日本日立公司；

核酸蛋白分析仪，型号：

DU800型，美国Beckman公司；

RealTime-PCR仪，型号：

CFX96，美国Bio-Rad公司；

梯度PCR仪，型号：

T100，美国Bio-Rad公司；

Westernbolt实验仪器

纯水机，型号：

E30131，英国ELGALABWATER公司；

制冰机，型号：

SD40，广州市广绅电器制造有限公司；

电子天平，型号：

PL203，上海梅特勒——托利多仪器有限公司；

高压蒸汽灭菌锅，型号：

YXQ-LS-75G，常州诺基仪器有限公司；

全自动干燥箱，型号：

DHG-9640C，杭州蓝天公司；

全自动洗板机，型号：

1575，美国BIO-RAD公司；

超低温冰箱，型号：

T11-86-340-LA，北京天地精仪科技有限公司；

台式高速离心机，型号：

TG-16W，长沙湘智离心机仪器有限公司；

手掌型离心机，型号：

LX-200，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

低温高速离心机，型号：

CR21GⅡ，日本日立公司；

转移脱色摇床，型号：

TS-8型，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

滚轴式混合器，型号：

SRT-202，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

数显恒温水浴锅，型号：

HH-2，常州澳华仪器有限公司；

旋涡混合器，型号：

QL-901，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

多功能酶标仪，型号：

spectraMAXM5，上海美谷分子仪器有限公司；

电脑型倒置荧光显微镜，型号：

DFM-60C，上海蔡康光学仪器有限公司；

激光共聚焦荧光显微镜，日本Olmpus公司；

蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司；

凝胶图像成像分析仪，美国Bio-Rad公司；

1.4westernbolt实验用到的溶液配制方法

10%SDS-PAGE分离胶（2块胶）：

蒸馏水2.7ml，10%过硫铵0.1ml，1MTris（pH8.8）3.8ml，10%SDS0.1ml，30%Acr-Bis（29:

1）3.3ml，TEMED0.004ml。

5%SDS-PAGE浓缩胶（2块胶）：

蒸馏水2.1ml，10%过硫铵0.03ml，1MTris（pH6.8）0.38ml，10%SDS0.03ml，30%Acr-Bis（29:

1）0.5ml，TEMED0.003ml。

10倍电泳缓冲液：

SDS10g，TrisBase30g，Glycine141.1g，蒸馏水定容至1000ml，充分搅拌至完全溶解，置冰箱4℃保存备用，使用时稀释10倍。

转膜液：

Glycine14.4g，TrisBase3.03g，蒸馏水定容至800ml，充分搅拌至完全溶解，置冰箱4℃保存备用，使用时加入200ml甲醇，使其终浓度为20%。

TBS：

TrisBase3g，NaCl8g，蒸馏水定容至800ml，充分搅拌至完全溶解，置冰箱4℃保存备用，使用时用HCl调pH值至7.4，以蒸馏水定容至1000ml。

TBST：

TBS加0.1%体积Tween-20。

PBS缓冲液：

Na2HPO41.42g，KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl8g，加入蒸馏水800ml充分搅拌至完全溶解，用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌，置冰箱4℃保存备用。

Real-TimePCR、WesternBolt检测Samd蛋白表达水平及其磷酸化水平

1.实验药品试剂

PCR所用实验用品：

生理盐水，批号：

20130116，山东康宁药业有限公司；

无水乙醇，批号：

32061，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

水合氯醛，批号：

30037517，上海国药集团化学试剂有限公司；

DEPC，武汉科瑞生物技术有限公司；

TRIzol，批号：

15596-026，美国Lifetechnologies公司；

氯仿，批号：

100068608，上海国药集团化学试剂有限公司；

异丙醇，批号：

32064，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

逆转录试剂盒，批号：

RR047A，宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKaRa公司）；

SYBRPremixExTaq[TM]，批号：

RR420A，宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKaRa公司）；

Westernbolt所用实验用品：

生理盐水，批号：

20130116，山东康宁药业有限公司；

无水乙醇，批号：

32061，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

水合氯醛，批号：

30037517，上海国药集团化学试剂有限公司；

脱脂奶粉，武汉科瑞生物技术有限公司；

Tween-20，武汉科瑞生物技术有限公司；

考马斯亮蓝快速染色液，武汉科瑞生物技术有限公司；

丽春红染液，武汉科瑞生物技术有限公司；

氯化钠，批号：

1266-2006，天津恒兴化学试剂制造有限公司

Glycine，武汉科瑞生物技术有限公司；

TrisBase，武汉科瑞生物技术有限公司；

SDS，武汉科瑞生物技术有限公司；

二甲苯，批号：

10023428，上海国药集团化学试剂有限公司；

HCl，批号：

81013，中国平煤神马集团开封东大化工有限公司；

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，批号：

P0012A，上海碧云天生物技术有限公司；

TEMED，批号：

ST728，上海碧云天生物技术有限公司；

Western一抗二抗去除液（强碱性），批号：

P0025，上海碧云天生物技术有限公司；

WesternBlot超敏发光液，批号：

P1010，北京普利莱基因技术有限公司；

RIPA裂解液，批号：

P0013，上海碧云天生物技术有限公司；

PMSF，批号：

329-98-6，北京中生瑞泰科技有限公司；

BCA试剂盒，批号：

P0010S，上海碧云天生物技术有限公司；

Prestainedproteinloadingbuffer，批号：

26617，美国Thermo公司；

PrestainedproteinMWmarker，批号：

26616，美国Thermo公司；

5×Loadingbuffer，武汉科瑞生物技术有限公司；

硝酸纤维素膜，批号：

T328591，美国Lifetechnologies公司；

一抗：

GAPDH抗体；p-Samd抗体（美国millipore公司）

二抗：

羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗，鼠抗羊二抗（武汉科瑞生物技术有限公司）；

大鼠β-actin引物、Samd引物。

英潍捷基（上海）贸易有限公司合成并经质量检测。

引物序列见表2。

表2引物序列

目的基因

引物序列

产物长度

β-actin

Forward：

5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′

171bp

Reverse：

5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′

Samd

Forward：

5′-CACTGGTTCCGAAAGGGACTC-3′

153bp

Reverse：

5′-CTGAAGCAAAAATCGCCACCT-3′

1.3实验仪器

PCR所需仪器

EP管，型号：

1.5ml，美国Axygen公司；

玻璃匀浆器，型号：

1ml，武汉科瑞生物技术有限公司；

移液器，型号：

0.1-2.5μL，0.5-l0μL，20-200μL，100-1000μL，美国Thermo公司；

去酶PCR管，型号：

0.2ml，美国Axygen公司；

八联管、盖，型号：

0.2ml，美国Axygen公司；

电子天平，型号：

PL203，上海梅特勒——托利多仪器有限公司；

高压蒸汽灭菌锅，型号：

YXQ-LS-75G，常州诺基仪器有限公司；

全自动干燥箱，型号：

DHG-9640C，杭州蓝天公司；

超低温冰箱，型号：

T11-86-340-LA，北京天地精仪科技有限公司；

低温高速离心机，型号：

CR21GⅡ，日本日立公司；

核酸蛋白分析仪，型号：

DU800型，美国Beckman公司；

RealTime-PCR仪，型号：

CFX96，美国Bio-Rad公司；

梯度PCR仪，型号：

T100，美国Bio-Rad公司；

Westernbolt实验仪器

纯水机，型号：

E30131，英国ELGALABWATER公司；

制冰机，型号：

SD40，广州市广绅电器制造有限公司；

电子天平，型号：

PL203，上海梅特勒——托利多仪器有限公司；

高压蒸汽灭菌锅，型号：

YXQ-LS-75G，常州诺基仪器有限公司；

全自动干燥箱，型号：

DHG-9640C，杭州蓝天公司；

全自动洗板机，型号：

1575，美国BIO-RAD公司；

超低温冰箱，型号：

T11-86-340-LA，北京天地精仪科技有限公司；

台式高速离心机，型号：

TG-16W，长沙湘智离心机仪器有限公司；

手掌型离心机，型号：

LX-200，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

低温高速离心机，型号：

CR21GⅡ，日本日立公司；

转移脱色摇床，型号：

TS-8型，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

滚轴式混合器，型号：

SRT-202，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

数显恒温水浴锅，型号：

HH-2，常州澳华仪器有限公司；

旋涡混合器，型号：

QL-901，海门其林贝尔仪器制造有限公司；

多功能酶标仪，型号：

spectraMAXM5，上海美谷分子仪器有限公司；

电脑型倒置荧光显微镜，型号：

DFM-60C，上海蔡康光学仪器有限公司；

激光共聚焦荧光显微镜，日本Olmpus公司；

蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司；

凝胶图像成像分析仪，美国Bio-Rad公司；

1.4westernbolt实验用到的溶液配制方法

10%SDS-PAGE分离胶（2块胶）：

蒸馏水2.7ml，10%过硫铵0.1ml，1MTris（pH8.8）3.8ml，10%SDS0.1ml，30%Acr-Bis（29:

1）3.3ml，TEMED0.004ml。

5%SDS-PAGE浓缩胶（2块胶）：

蒸馏水2.1ml，10%过硫铵0.03ml，1MTris（pH6.8）0.38ml，10%SDS0.03ml，30%Acr-Bis（29:

1）0.5ml，TEMED0.003ml。

10倍电泳缓冲液：

SDS10g，TrisBase30g，Glycine141.1g，蒸馏水定容至1000ml，充分搅拌至完全溶解，置冰箱4℃保存备用，使用时稀释10倍。

转膜液：

Glycine14.4g，TrisBase3.03g，蒸馏水定容至800ml，充分搅拌至完全溶解，置冰箱4℃保存备用，使用时加入200ml甲醇，使其终浓度为20%。

TBS：

TrisBase3g，NaCl8g，蒸馏水定容至800ml，充分搅拌至完全溶解，置冰箱4℃保存备用，使用时用HCl调pH值至7.4，以蒸馏水定容至1000ml。

TBST：

TBS加0.1%体积Tween-20。

PBS缓冲液：

Na2HPO41.42g，KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl8g，加入蒸馏水800ml充分搅拌至完全溶解，用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌，置冰箱4℃保存备用。

1.多囊卵巢综合征动物模型选择

多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndromePCOS）是妇科常见的生殖功能障碍性疾病,主要表现为卵巢的雄激素过多所造成的闭经、多毛、肥胖及无排卵,其发生率占生育年龄妇女的5%～10%[1]。

目前多囊卵巢综合征动物模型主要有芳香酶抑制剂造模法、雄激素造模法、雌激素造模法、孕激素联合HCG造模法、胰岛素（INS）联合HCG造模法及转基因动物模型。

多囊卵巢并非一种简单独特的疾病,而是一种多病因,临床表现多态性的综合征,病理生理变化涉及广泛,包括神经、内分泌及代谢系统和卵巢局部的调控因素,造成某个调节机制的不平衡而出现的各种反馈失常和连锁反应[2]。

且PCOS的病理生理是一个复杂的问题,数十年来从不同途径和不同的对象进行逐步深入的探索,结果有相互补充的观点,也有许多争论的问题,已被公认的特征有:

（1）雄激素过多;

（2）高LH伴有正常或低水平的FSH;（3）恒定的雌激素平;（4）卵巢组织形态学上有多个囊性卵泡和间质增生;（5）高胰岛素血症和胰岛素抵抗。

据报道采用来曲唑造模可使大鼠血清睾酮升高、胰岛素抵抗、卵巢多囊样变，大鼠病理生理特征极度接近于人类PCOS特征，是研究该病较为理想的动物模型，且该造模方法与其他注射药物或皮下埋值的方法比较，对大鼠创伤性更小，操作更简便[3]。

本实验来曲唑造模大鼠出现典型的PCOS表现:

阴道脱落细胞涂片失去规律动情周期，阴道上皮细胞均停留在早卵泡期阶段，提示无排卵;病理结果显示大鼠卵巢呈多囊样改变;血清睾酮升高;体重增加;空腹胰岛素升高，提示存在胰岛素抵抗。

综上所述，本实验选用来曲唑成功地制造了PCOS大鼠模型。

[1]冯光荣,尤昭玲,贺冰,等.多囊卵巢综合征动物模型建立的研究现状与展望[J].中医药导报,2004,10

（1）:

45-46.

[2]李淑萍.五积散对痰湿型多囊卵巢综合征生殖激素和糖脂代谢的临床和实验研究[D].南京中医药大学,2011.

[3]郑慧颖.黄连素对多囊卵巢综合征大鼠高雄激素状态及StAR蛋白质、mRNA表达的影响[D].湖北中医药大学,2016.