最新高三生物届高三生物一轮复习必备专题二十.docx
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最新高三生物届高三生物一轮复习必备专题二十
专题二十二基因工程
一、考点解读
1、考点盘点
内容
说明
（1）基因工程的诞生；
（2）基因工程的原理及技术；
（2）基因工程的应用；
说出基因工程的概念
简述基因工程的诞生历程
认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新
分析基因工程研究的理论基础
说出DNA重组技术所需的三种基因工具的作用
简述基因工程基本操作程序的四个步骤
简述目的基因的获得、运载体的构建、目的基因的导入与检测等常用的方法及其基本原理
举例说出基因工程在农业、医疗、环境保护等方面的广泛应用及其发展前景
关注基因工程的发展，认同基因工程的应用促进生产力的提高
2、考点解读
基因工程属于生物科技前沿的内容，这一专题的教学，首先要考虑基础性。
高中阶段的教学不是培养专家，而是要全面提高学生的科学素养，因此，着力点应瞄准对学生的发展起根本作用的知识、能力、思想情感上。
忽视了这一点，而一味追求知识的深和透，就会本末倒置，影响学生的全面发展。
本专题教学的另一个重要原则就是要在学生原有的知识、经验基础上提升。
违背了渐进性，易使学生认为“基因工程难学”而产生“危乎高哉”的想法，望而却步。
紧密联系学生已有的经验、生活阅历，尽量紧密联系必修课中的基础知识，一步步引领学生登上这一科技前沿的舞台，学生们才会心驰神往地投入到学习中来。
在学习本专题内容时，不能忽视知识与能力、情感态度与价值观的有机结合。
情感态度与价值观是学习的动力，要利用国际上重大科技成果的素材，开阔学生的视野，增强他们奋发图强的紧迫感；利用国内重大科技成果的素材，培养他们自强不息的民族精神，从而唤起他们学习的积极性。
本专题多数内容都与其他专题有紧密的联系。
关于转基因生物，在学习技术知识的基础上应引导学生主动学习《生物技术的安全性和伦理问题》专题。
《胚胎工程》中有关胚胎移植技术的内容，可使学生对培育转基因动物有更加透彻的理解。
《细胞工程》中介绍植物细胞培养技术，是目的基因导入植物细胞、培育转基因植物的重要环节。
另外，学习本专题内容时，密切关注《生态工程》专题中呈现的生态环境问题，思考利用基因工程的方法，解决生态环境问题中常规技术难以解决的问题。
二、知识网络
DNA是遗传物质的证明
理论基础DNA双螺旋结构和中心法则的确立
遗传密码的破译
基因转移载体的发现
工具酶的发现
DNA合成和测序技术的发现
工程技术DNA体外重组的实现
重组DNA表达实验的成功
第一例转基因动物的问世
PCR技术的发明
来源：
主要从原核生物中分离
功能：
能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，
限制性内切酶并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷
（分子手术刀）酸二酯键断开。
切割后的DNA末端：
黏性末端
平末端
功能：
将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子
DNA连接酶T4DNA连接酶：
既能“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，
（分子缝合针）种类也能“缝合”双链DNA的平末端
E·coliDNA连接酶：
只能将双链片段互补的黏性末端连接
能在宿主细胞中保存下来并大量复制
条件：
有一个至多个限制酶切割点，
基因进入受体细胞的载体有特殊的遗传标记基因，便于筛选。
（分子运输车）质粒（常用）
种类：
λ噬菌体的衍生物
动植物病毒
基因文库
从基因文库中获取基因组文库
目的基因的获取方法 部分基因文库
人工合成
PCR：
是一项在生物体外复制特定
DNA片段的核酸合成技术。
利用PCR技术扩增目的基因目的：
获取大量的目的基因
原理：
DNA复制
过程
目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，
基因表达载体的构建并使目的基因能够表达和发挥作用。
（基因工程的核心）目的基因：
基因表达载体的组成：
启动子：
终止子：
标记基因：
转化：
目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定
和表达的过程
农杆菌转化法
导入植物细胞的方法：
基因枪法
将目的基因导入受体细胞方法：
花粉通道法
导入动物细胞的方法：
显微注射技术
导入微生物的方法：
检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因
检测：
方法：
分子杂交技术（DNA探针+转基因生物DNA）
目的基因的检测和鉴定检测目的基因是否转录
方法：
分子杂交技术（DNA探针+转基因生物mRNA）
检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
鉴定：
对生物进行个体水平的鉴定
抗虫转基因植物
抗病转基因植物
转基因植物抗虫逆转基因植物
改良植物品质
提高动物生长速度
改善畜产品的品质
转基因动物用转基因动物生产药物
用转基因动物作器官移植的供体
基因工程药物
基因治疗
基础过关
三、本单元分课时复习方案
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
（一）基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：
能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：
经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：
黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：
都缝合磷酸二酯键。
②区别：
E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同:
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：
噬菌体的衍生物、动植物病毒
（二）基因工程的基本操作程序
第一步：
目的基因的获取
1.目的基因是指：
编码蛋白质的结构基因。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：
DNA双链复制
（2）过程：
第一步：
加热至90～95℃DNA解链；第二步：
冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：
加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：
基因表达载体的构建
1.目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：
目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：
是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：
也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：
是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：
将目的基因导入受体细胞_
1.转化的概念：
是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：
采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：
最常用的方法是显微注射技术。
此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：
原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：
先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步：
目的基因的检测和表达
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。
如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
（三）基因工程的应用
1.植物基因工程：
抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2.动物基因工程：
提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
3.基因治疗：
把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
核心考点整合
一．基因工程的概念
基因工程的别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
结果
人类需要的基因产物
二．基因工程的工具及其比较
1、基因工程的操作工具
（1）分子手术刀——限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶简称限制酶，主要存在于原核生物中，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
目前已经发现了200多种限制酶。
例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。
苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端（如下图所示）。
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
注意：
①用限制酶切割DNA分子时，被破坏的是DNA链中的磷酸二酯键（即连接相邻两个脱氧核苷酸的键）。
②黏性末端是指双链DNA分子被限制酶切开后，切口处的两个末端伸出的由若干特定核苷酸组成的单链。
（2）分子缝合针——DNA连接酶
从上图中可以看出，把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让二者的黏性末端按碱基互补配对原则形成双链，用DNA连接酶催化两条DNA链的相邻两个碱基之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核苷酸连接起来。
DNA连接酶有两类：
一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coliDNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的．称为T4DNA连接酶。
E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。
而T4-DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率较低
（3）分子运输车一——基因进入受体细胞的载体
①使用运载体的目的
在基因工程中使用运载体有两个目的：
一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。
②运载体的种类
现在所利用的运载体主要有两类：
一类是细菌的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌核区DNA之外的双链环状DNA。
另一类运载体是噬菌体或某些灭活的病毒等。
现在人们还在寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体等也有可能成为运载体。
③基因的运载体必须具备的条件
a．载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。
这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而导致其自身失活。
b．载体DNA必须具备自我复制的能力，或可以整合到受体染色体DNA上随受体染色体DNA的复制而同步复制。
c．载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
d．载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，不能进入到除受体细胞以外的其他生物细胞中去。
e．载体DNA分子大小应适中，以便提取和在体外进行操作，太大则不便操作。
一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改造现在使用的质粒载体几乎都是经过改造的。
三．植物基因工程与动物基因工程的成果
四.获取目的基因的方法
从基因文库中获取
鸟枪法
人工合成
3．目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）
4．将目的基因导入受体细胞
受体细胞：
细菌
↓氯化钙
细胞壁的通透性增大
↓
重组质粒进入受体细胞
↓
目的基因随受体细胞的繁殖而复制
五.植物基因工程的应用
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等）以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
1.提高抗逆性
（1）常用抗虫基因：
用于抗虫（杀虫）的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
（2）常用抗病基因：
a.抗病毒基因有：
病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因；b.抗真菌基因有：
几丁质酶基因和抗毒素合成基因
（3）其他抗逆基因：
环境条件对农作物的生产会造成很大影响，并且这些影响是多方面的，因此，抗逆性基因也有多种多样，如：
抗盐碱和干旱的调节细胞渗透压基因、抗冻基因、抗除草剂基因等等。
2.改良植物品质
由于人们的食品含有的营养不平衡，不能满足人们对食品的要求，这样，可以通过转基因技术，使植物能够合成某些本来不能合成的物质。
如科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。
3.生产药物
基因工程不但促进了传统技术的变革，也为人类提供了传统产业难以得到的许多昂贵药品，并已形成基因工程制药业的雏形。
目前诸如人胰岛素、人生长激素、人脑激素、
α－干扰素、乙肝疫苗、蛋白C、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂等数十种基因工程药物已实现商品化。
此外，还有促红细胞生成素、白细胞介素－2、肾素、心钠素等一大批珍贵药品正处于试用或临床试验阶段。
六．动物基因工程的应用
1.用于提高动物生长速度：
由于外援生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。
如：
转基因绵羊和转基因鲤鱼。
2.用于改善畜产品的品质：
基因工程可用于改善畜产品的品质。
如：
有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，这样所获得的牛奶其成分不受影响，但乳糖的含量大大减低。
3.用转基因动物做器官移植的供体：
目前，人体移植器官短缺是一个世界性的难题，用其它动物的器官替代，又会出现免疫排斥现象，现在，科学家正试图利用基因工程方法对一些动物的器官进行改造，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官。
七．基因治疗
1.概念：
基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
2.方法：
体外基因治疗和体内基因治疗
体外基因治疗：
先从病人体内获得某种相关细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内，这种方法叫做体外基因治疗。
体内基因治疗：
直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法叫做体内基因治疗。
说明：
对于遗传病的治疗最根本的方法是进行基因替换或修复。
基因治疗的最佳时期理论上是受精卵时期，这样可以使个体的每个细胞都含有正常基因，但在现实生活中是不可能的，因为不可能人人在受精卵时期进行基因检查。
其次是对患者进行相关细胞的基因替换，如：
对于遗传性糖尿病患者，只对胰腺的B细胞进行基因替换，该个体就能正常分泌胰岛素，糖尿病得以治疗；但这种局部细胞的基因替换，并没有改变其它部位细胞的基因，如精原细胞，其后代很大可能还会患遗传性糖尿病。
八．基因治疗的过程（以镰刀形细胞贫血症的治疗为例）
步骤
过程
获取正常的血红蛋白基因
用限制性核酸内切酶从人的DNA分子中切取血红蛋白基因
形成重组载体
用同一种限制性核酸内切酶在载体DNA上切开一个切口，用DNA连接酶将正常血红蛋白基因连接在载体DNA上，形成重组载体
重组载体的转化与筛选
将携带正常血红蛋白基因的重组载体导入患者的造血干细胞中，并将重组载体插入到染色体。
用选择培养基筛选出含重组质粒的造血干细胞。
将含正常血红蛋白基因的造血干细胞回输给患者骨髓
将携带正常血红蛋白基因的造血干细胞输入患者骨髓中，此造血干细胞产生含正常血红蛋白的红细胞，以根治镰刀形细胞贫血症
九．利用微生物生产药物的优越性
所谓利用微生物生产蛋白质类药物，是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因，构建成表达载体后导入微生物，然后利用微生物发酵来生产蛋白质类药物。
与传统的制药相比有以下优越性：
1.利用活细胞作为表达系统，表达效率高，无需大型装置和大面积厂房就可以生产出大量药品。
2.可以解决传统制药中原料来源的不足。
例如，胰岛素是治疗糖尿病患者的药物，一名糖尿病患者每年需用的胰岛素需要从40头牛或50头猪的胰脏中才能提取到。
1978年科学家用2000L大肠杆菌发酵液得到100g胰岛素，相当于从1000kg猪胰脏中提取的量。
又如，生长素是治疗侏儒症患者的药物，治疗一名侏儒症患者每年需要从80具尸体的脑下垂体中提取生长素。
利用基因工程菌发酵生产就不需要从动物或人体上获取原料。
3.降低生产成本，减少生产人员和管理人员。
十．转基因食品：
转基因食品是通过遗传工程改变植物种子中的脱氧核糖核酸，然后把这些修改过的再复合基因转移到另一些植物种子内，从而获得在自然界中无法自动生长的植物物种。
上世纪80年代末，科学家们开始把10多年分子研究的成果运用到转基因食品上，1995年成功地生产出抗杂草黄豆，并在市场上出售。
又经过7年的努力，现在他们利用基因技术已批量生产出抗虫害、抗病毒、抗杂草的转基因玉米、黄豆、油菜、土豆、西葫芦等。
目前，转基因食品的主要产地是美国、加拿大、欧盟、南非、阿根廷等。
转基因食品安全评价：
随着转基因技术向农业、食品和医药领域的不断渗透和迅速发展，转基因食品安全性现成为全球关注的热点问题之一
名师点睛
1．（09浙江卷3）下列关于基因工程的叙述，错误的是
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
解析：
基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性。
载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。
所以D错误。
答案：
D
2．（09广东理基45）．钱永健先生因在研究绿色荧光蛋白方面的杰出成就而获2008年诺贝尔奖。
在某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光。
由此可知
A．该生物的基因型是杂合的
B．该生物与水母有很近的亲缘关系
C．绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达
D．改变绿色荧光蛋白基因的1个核苷酸对，就不能检测到绿色荧光
解析：
某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光，说明绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达。
答案：
C
3．（09安徽卷4）．2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。
将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。
绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是
A．追踪目的基因在细胞内的复制过程
B．追踪目的基因插入到染色体上的位置
C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布
D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构
解析：
将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质带有绿色荧光，从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。
故C正确。
答案：
C
4.（09上海理综卷20）．科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。
图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是
A．基因自由组合定律B．半保留复制原则
C．基因分离定律D．碱基互补配对原则
解析：
本题考查基因工程的相关知识，重组质粒依据的是粘性末端的碱基互补配对原则。
答案：
D
5（09江苏卷34）．（7分）苏云金杆菌（Bt）能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。
下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图（
为抗氨苄青霉素基因），据图回答下列问题。
（1）将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有种DNA片段。
（2）图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得种重组质粒；如果换用Bstl与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得种重组质粒。
（3）目的基因插入质粒后，不能影响质粒的。
（4）图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的T—DNA导人植物细胞，并防止植物细胞中对T—DNA的降解。
（5）已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。
而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞。
（6）生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的
基因频率的增长速率。
解析：
本题考查基因工程的相关知识。
（1）由于上述两种酶形成的末端不一样，所以被两种不同的限制酶切割之后所形成的片段有AA、AB、BA、BB四种切法形成的四种片段。
（A表示HindⅢ，B表示BamHⅠ）
（2）同时被两种限制酶切割有两种不同的目的基因，即AB和BA，所以重组质粒有两种。
Bstl与BamHⅠ酶切割的末端一样，所以同时用这两种限制酶切割只能形成一种目的基因，所以只能形成一种重组质粒。
（3）质粒要进行复制才能更多的表达出产物，所以重组之后要能复制。
（4）酶具有专一性，对T—DNA的降解酶为DNA水解酶。
（5）生物的细胞表面的受体具有特异性，人类肠上皮细胞没有昆虫肠上皮细胞表面的特异受体。
所以该毒素蛋白对人类的风险相对较小（6）自然选择是普遍存在的，纯种种植自然选择会使害虫抗性基因频率快速增长。
所以混合种植降低害虫的抗性基因频率的增长速率。
答案：
（1）4
（2）21
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