镍柱纯化原理及方法.doc

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镍柱亲和层析

亲和层析的原理：

利用分子间存在特异性的相互作用，它们之间都能够进行专一而又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。

常见具有专一性亲和力的生物分子对：

酶：

基质类似物，抑制剂，辅酶

抗体：

抗原，病毒，细胞

细胞：

细胞表面特异蛋白，外源凝集素

核酸：

互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶

激素或药物：

受体，载体蛋白

外源凝集素：

多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞

文献将被固定在色谱基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。

配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。

一般载体采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。

咪唑环：

是1，3二氮杂戊环，英文名是Imidazole,如果在第一位或第三位上的氮原子上去掉那个氢原子所剩余的部份，就叫咪唑基。

就是咪唑上去掉一个和氮原子直接相连的氢原子后剩下的部分

组氨酸的性质：

具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。

金属离子：

Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。

过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。

镍离子：

有六个螯合价位，通常将镍柱分为了Ni-NTA和Ni-IDA。

Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。

因此Ni-IDAAgarose结合作用力要比Ni-NTAAgarose强，在同样条件下Ni-IDAAgarose的载量要比Ni-NTA高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。

因此需要根据不同的纯化条件选择纯化所需的镍柱，以达到纯化的最佳效果。

基质：

①不溶性的多孔网状结构，渗透性好；

②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；

③抗微生物和酶的侵蚀；

④最好为粒径均一的球形粒子；

⑤具有亲水性，无非特异性吸附；

⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。

例：

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。

Sepharose4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

配基：

是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子，能够通过亲和色谱的方式进行纯化。

配基的选择受到两种因素的影响：

（1）：

配基与目标物的结合必须具有特异性和可逆。

（2）：

必须具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不损害它的活性。

间隔臂：

目标蛋白质的结合位点位于分子中较深的部位，如果将配基直接偶联到基质上，受到空间位阻的影响，配基不能到达目标蛋白的结合位点，因此与目标蛋白的结合能力低。

于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容易。

间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。

间隔臂的长度是关键，太短，无效;太长，发生非特异性结合。

一般规则：

偶联的分子量小于1000时使用间隔臂；当大分子量，则不一定要。

二硫键：

蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成，包内蛋白离开细胞后，二硫键常以氧化状态存在。

此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。

为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线状多肽链。

上样方式：

（1）直接上样

（2）间接上样

洗脱方式：

（1）pH值洗脱：

pH的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程度，使它们结合位点的亲和性降低。

（降低pH的方法）

（2）离子强度洗脱：

（3）竞争性洗脱：

（咪唑）

再生：

（1）先用强变性剂6M盐酸胍冲洗柱子

（2）用水冲洗干净

（3）0.2%SDS冲洗柱子

（4）用水冲洗干净

（5）50%乙醇冲洗柱子

（6）用水冲洗干净

（7）用100mMEDTA（50mMTris100mMEDTAPH8.0）冲洗柱子

（8）用水冲洗干净

（9）用100mM硫酸镍孵育柱子

（10）20%乙醇中4℃保存

上清缓冲液及配方

上清纯化缓冲液

配方

LysisBuffer

50mMTris-HCl；150mMNaCl；20mMImidazole；pH8.0；

ElutionBuffer1

50mMTris-HCl；150mMNaCl；50mMImidazole；pH8.0；

ElutionBuffer2

50mMTris-HCl；150mMNaCl；100mMImidazole；pH8.0；

ElutionBuffer3

50mMTris-HCl；150mMNaCl；300mMImidazole；pH8.0；

包涵体缓冲液及配方

包涵体纯化缓冲液

配方

IBLysisBuffer1

20mMTris；150mMNaCl；2mMEDTA；2mMDTT；1%TritonX-100；PH8.0；

IBLysisBuffer2

50mMTris-HCl；150mMNaCl；8Murea；pH8.0；

IBElutionBuffer1

50mMTris-HCl；150mMNaCl；20mMImidazola；8Murea；pH8.0；

IBElutionBuffer2

50mMTris-HCl；150mMNaCl；50mMImidazola；8Murea；pH8.0；

IBElutionBuffer3

50mMTris-HCl；150mMNaCl；100mMImidazola；8Murea；pH8.0；

IBElutionBuffer4

50mMTris-HCl；150mMNaCl；300mMImidazola；8Murea；pH8.0；

IBElutionBuffer5

50mMTris-HCl；150mMNaCl；500mMImidazola；8Murea；pH8.0；

试剂及作用

1.TritonX-100（曲拉通）：

具亲水端和疏水端，可将膜蛋白从细胞膜上解离下来，达到提取膜蛋白的作用。

常用的非离子性去垢剂。

用量：

1%-3%TritonX-100。

2.TCEP（三（2-羧乙基）膦）：

是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。

该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。

在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。

与其他类别的硫醇类还原剂如DTT相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉。

用量：

1mM/ml.

3.Pepstatin（胃蛋白酶抑制剂）：

抑制酸性蛋白酶，配置时溶于甲醇中，在水中不溶解。

用量：

1ug/ml。

Storeat:

-4℃（Aweek）/-20℃（Halfayear）。

4.Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：

抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，配置时溶于水，用量：

1ug/ml。

Storeat:

-4℃（Aweek）/-20℃（Halfayear）。

5.EDTA（乙二胺四乙酸）：

螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用。

不影响蛋白质功能的情况下去除干扰金属离子，但是同时能使金属蛋白酶丧失活性。

用量：

0.1—5mmol/L。

6.Glycerol（甘油）：

增加黏度，减少分子间的碰撞，用量：

5%-30%。

7.SDS（十二烷基硫酸钠）：

能够使蛋白质变性的阴离子型去污剂，用量：

0.1%-1%。

8.TritonX-114（曲拉通）：

温度在22℃以上时，在蛋白质溶液中加入2%的TritonX-114可使蛋白质从去垢剂相和液相中分离，可溶性蛋白在液相中，而膜蛋白则进入了去垢相中。

（内毒素存在于细胞壁组分，菌裂解后释出物中。

）

9.DTT（二硫苏糖醇）：

常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1%SDS）。

用量：

1-2mM.

10.L-Arginine（L-精氨酸）：

增加蛋白质的溶解性，阻止蛋白质分子间通过疏水作用发生凝聚而产生沉淀。

用量：

0.4-0.6mol/L.

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