细胞培养标准操作程序(SOP).doc
《细胞培养标准操作程序(SOP).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养标准操作程序(SOP).doc（6页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
细胞培养标准操作程序（SOP）
1．目的:
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：
3。
1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.1 1000ml培养液的配制
1、准备用品：
培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min.
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末.
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI—1640配制1000ml需加NaHCO3粉2。
0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌.无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7。
0左右（细胞适宜在PH7。
2~7。
4生长，配制好后PH值会升高0。
2～0。
3，故配时调PH至7。
0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml.
6、配青霉素 80万/瓶 +4ml 蒸馏水 溶解
配链霉素100万/瓶 +4ml 蒸馏水 溶解
取0。
5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放—20℃保存备用.
注意：
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！
烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗
水）的容器均不需高压灭菌,干净即可.
3。
1.2 PBS（平衡盐溶液）的配制
NaCl 8g
KCl 0。
2g ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml
Na2HPO4＊H2O 1.56g
KH2PO4 0。
2g
（1） 无需调PH值，其成分溶解后PH为7。
4,不需除菌滤膜过滤除菌,放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头！
）
（2） Na2HPO4＊H2O 1.56g 则Na2HPO4＊12H2O需3。
4888g
（3） 如欲配制500ml，以上成分减半即可
3.1。
3 0.25%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉 2。
5g
EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3g
NaCl 8。
0g
KCl 0。
4g ` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML
NaHCO3 0.5g
Glucose（葡萄糖） 1。
0g
酚红 0.06g
（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7。
6～7。
8范围内，故不需调PH值.
（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。
4℃可连续使用1月左右.
（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！
而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
（4）如欲配制500ml,以上成分减半即可
3.2 细胞复苏
1、准备：
紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。
在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）.
3、戴手套，从—196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻,同时不断轻轻摇动冻存管,保证冻存管内细胞1min内融化。
以70％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（慢冻快融）
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液,加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管,800rpm离心2min（用培养基且离心的目的：
去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞,轻弹混匀。
往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。
用吸细胞液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,以免在培养瓶里成团,影响细胞生长.
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。
（注意：
加入到培养瓶后,培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁,左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。
）
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台，保持台面整洁。
注意:
（1）入细胞室前观察CO2％压力，5—7。
5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa!
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％.
（3）离心时间为1～2min,速度为800转,不要离心太久，避免对细胞伤害较大。
（4）滴管使用注意事项：
a.吸细胞液专用一个滴管,各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用,防止细胞间污染.
b。
培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！
c。
FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用.
d．胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。
死亡原因:
冻存时间太长（如2年以上），技术不过关（如吹打太激烈）、细胞传代数太多等.
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:
a。
PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头.
b。
PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。
PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向,故不可经常冲洗细胞。
c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化.
d．消化后暂时不养细胞的培养瓶,可以往其中加入2~3mlPBS（防止培养瓶干燥），培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。
下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大,而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！
3.3 细胞换液
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：
a.移动细胞培养瓶时,观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞;
b。
生长状态良好的细胞：
透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c.生长状态不良的细胞:
细胞折光性变弱，轮廓增强,胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则,失去原有特点。
d。
只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。
2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS（胎牛血清）可不温。
实验开始时打开照明灯和抽风机，用75％酒精喷双手.酒精灯点燃放中间。
滴管放滴管架上，从左到右顺序为:
吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管.从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边.
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90％部位）灼烧。
细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中,尽量吸干净。
注意：
滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内,避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染;滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）!
4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS10滴加入到培养瓶中。
（使FBS浓度为10%）
5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通.平放回CO2培养箱中。
6、收拾所用物品、用75％酒精喷洒操作台,擦台，保持台面整洁。
注意:
（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作.灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开.
（2）镊子每次使用前均需灼烧。
装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。
注意：
除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加.已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧!
滴管千万不能混用！
（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。
（5）培养液以没过细胞为宜。
（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液.不要求每天换液，容易增加污染机会.
3。
4 细胞计数
1、原理:
（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0。
1mm=1。
0x10-4ml。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目.
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104
注意:
镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2、计数方法:
（1）75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。
（2） 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边,再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘（注意不要溢出,不要有气泡）.
（3） 观察计数：
压线的记左不记右,记上不记下；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4×）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10×）进行计数。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104
（4） 计数完毕用75％酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。
3.5 细胞传代
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、取灭菌试管1支，配完全培养基（含10％FBS）3ml（培养基：
FBS=54滴：
6滴）.
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化：
加入约1ml（20滴）胰酶到培养瓶里消化。
胰酶铺平培养瓶底为佳。
倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）.
5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮,细胞间隙明显增大时，用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。
6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。
吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。
新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次,靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液.
7、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满，待有经验后此步骤可以省略。
如需进一步进行铺板则一定要计数！
）
8、传代：
不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1:
5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀3ml（60滴）细胞悬液,取12滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基（培养基：
FBS=9：
1）使液体总体积达到4ml，平放到CO2培养箱中继续培养。
9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台，保持台面整洁。
注意：
（1）对于难消化的细胞（如Bxpc-3胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用1~2ml（即20~40滴,或1～2滴管）4 ℃PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤.
（2）一定要防止细胞过消化！
因过消化，使细胞成团，不均匀,且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。
＊ 过消化特征：
a。
在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下来的细胞.
b.培养瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长）,而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培养瓶底板有一片片空隙。
（3）过消化的处理：
不吸出胰酶，立刻加入3ml完全培养基终止消化后一并收集入试管中，经过800rpm 离心3min,弃去上清（失活的胰酶、培养基、FBS）。
细胞沉淀（白色沉淀物）在试管底，用手指轻弹打散细胞,重新加入适量完全培养基，混匀后放入培养瓶中继续培养。
（4）在加入未经37℃温育的胰酶（指仅为室温）消化细胞时，即使细胞已经变圆，且透亮，用完全培养基终止消化后仍很难吹打下来.那是因为胰酶的温度不适宜；而应该把残留有胰酶作用的培养瓶放到CO2培养箱中，放置5min,让胰酶在其最佳温度（37℃）下消化细胞。
（5）把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体,以防止细胞成团不均，影响在培养瓶中生长。
（6）用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害，故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生.
（7）吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。
（8）完全培养基为含有10%FBS（胎牛血清）的培养液（基）。
（9）小牛血清使用范围：
5～20%，10%最常用。
血清可控制细胞生长速度，若想减慢细胞生长速度可减少血清浓度，反之亦然。
对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，则血清用20％。
（10）一般25c㎡培养瓶需培养液5ml，通常需90滴培养基+10滴胎牛血清（FBS）,一滴液体体积为50ul，即20滴为1ml。
（11）一般细胞生长铺至瓶底约80％，则可传代或用来做实验,否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化，不易用于后续实验。
3.6 细胞铺板（如12孔板）
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、在灭菌试管1中配完全培养基3ml（培养基：
FBS=54滴：
6滴）
3、消化同前，注意防止过消化。
吹打混匀计数,如为：
8。
0×10 5个/ml
4、稀释细胞悬液：
根据经验，细胞密度0.8×10 5个/ml较合理,因每孔需加培养液1ml，共需12ml，分2次，每次6ml（因试管体积有限,6ml即120滴），则配制细胞悬液：
8。
0×10 5个/ml×xml=0.8×10 5个/ml×6ml,x=0。
6ml
即 细胞原液：
0.6ml×20滴/ml=12滴
完全培养基:
6ml—0。
6ml=5。
4ml （5.4×20滴=108滴）
97滴培养基+11滴FBS
故取12滴细胞悬液、108滴完全培养液加入试管中。
用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。
5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，注意无菌操作.每孔1ml（20滴），分4次滴加,每次5滴，按顺序依次滴入。
注意：
每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀！
6、继续稀释细胞悬液6ml,操作同前。
7、加完之后，小心平稳地将培养板放入培养箱内，静置5min后,在显微镜下观察细胞是否铺均匀,如不均匀，将影响后续实验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：
因孔内细胞悬液1ml,采用700ul枪吹打（不能用滴管，会刮花底面），可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。
注意：
小心吹打,最好不要起气泡，否则会导致细胞不均，且影响观察.吹打后放倒置显微镜下观察，若不够均匀，继续吹打。
将细胞板拿出操作台时需盖板盖，避免污染。
8、吹打完毕后，小心将细胞板放CO2培养箱培养。
（注意：
拿细胞板避免晃动，最好直拿直放，不要推动移动，否则细胞容易成团.）
9、清洁操作台面，用75%酒精喷洒操作台，擦台。
注意：
（1）若铺96孔板，则需在96孔板周围一圈孔中加入PBS，防止干燥。
（2）各种不同规格板的铺板细胞数量：
板型
细胞密度（孔）
体积/孔
需细胞数
吹打加样枪头
6孔板
0。
6～0。
8×10 5个/ml
2ml
4×10 4
1ml
12孔板
0.6～0。
8×10 5个/ml
1ml
6~8×10 4
700ul
24孔板
0。
8~1。
0×10 5个/ml
0。
5ml
4～5×10 4
300ul
96孔板
1。
0×10 5个/ml
0.1ml
1×10 4
50ul
3。
7 细胞冻存
1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度.
2、依细胞传代培养之操作,收集培养之细胞于试管中，取少量细胞悬浮液，计数细胞浓度,一般冻存细胞浓度约1~5×106 cells/ml，依细胞种类而异.
3、用试管塞塞住试管，配平，800rpm 离心3min,去除上清液,加入适量完全培养液,使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀。
4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中，再加入2滴FBS,2滴DMSO（二甲基亚砜，为细胞冻存保护剂），使FBS浓度为20％，DMSO浓度为10%。
盖紧冻存管盖，在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。
5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时（勿超过1周），然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。
注意：
（1） 注意冷冻保护剂之品质.DMSO应为试剂级等级,无菌且无色（以0。
22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD—2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
（2）冷冻保存之细胞浓度：
①normalhumanfibroblast：
1～3×106cells/ml
②hybridoma：
1～3×106cells/ml,细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:
5~7×106，依细胞种类而异.Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④othersuspensions：
5～10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
（3）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败.
（4）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，且能以较快的速度渗透到细胞内,故冻存细胞时使用室温下的DMSO，在冻存的细胞复温后,应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO对细胞产生毒性.
升级会员 