时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究解读.docx
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时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究解读
第24卷,第5期 光谱学与光谱分析2004年5月 SpectroscopyandSpectralAnalysisVol124,No15,pp5962599
May,2004
时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究
郭周义,田 振,贾雅丽
华南师范大学激光生命科学研究所,广东广州 510631
摘 要 时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物,标记蛋白质、激素、抗体、核
酸探针或生物活性细胞,待反应体系（如:
抗原抗体免疫反应、生物素亲合反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等发生后,用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度,的。
它之所以能够继放射性同位素标记、酶标记、化学发光、更灵敏的检测方法,3+
命荧光团Eu螯合物的光谱研究结果,:
336～337nm
3+
的激发波长,有利于Eu主题词 免疫分析;;Eu3+螯合物中图分类号:
A 文章编号:
100020593（20040520596204
111 f—f跃迁光谱
引 言
最近几年发展起来的时间分辨荧光免疫分析方法（TR2
FIA是超微量免疫检定法的一大突破。
由于使用了时间分辨光谱技术和荧光增强技术,使荧光免疫分析的灵敏度得到了极大提高。
1983年Petterson[1]和Eskola[2]首先将时间分辨荧光光谱技术应用于免疫分析的研究中。
目前,TRFIA的最低检出值已达10-19mol・well-1,远远超过酶标记免疫分析法（EIA的10-9mol・well-1,放射免疫分析法（RIA的10-15mol・well-1和发光免疫分析法（LIA的10-15mol・L-1。
稀土离子是金属离子,若用来直接标记抗原、抗体,标记率很低,一般使用含有双功能基团的螯合剂,形成稀土离子2螯合剂2抗原（或抗体的螯合物。
稀土离子的荧光,不仅与自身的能级结构有关,而且与螯合剂的性质有关。
螯合物不同,稀土离子的激发光和发射光也会有所不同。
指fn组态内,不同J能级间跃迁所产生的光谱。
它的特点是:
（1发光弱。
这主要是因为f—f跃迁是宇称选择规则禁
1 稀土离子的吸收光谱
镧系离子的电子排布为
2
1s2s22p63s23p63d104s24p64d104fn5s25p6（n=0～14,其主要价态有二价、三价和四价。
三价态是特征氧化态,其
n
基组态是4f（n=0～14,下一个激发态是4fn-15d[3]。
稀土离子吸收光谱[4]的产生可归因于三种情况。
收稿日期:
2003203226,修订日期:
2003206228
阻的。
虽然在溶液和固态化合物中,由于配体场微扰,也能
观察到相应的光谱,但相对于d—d跃迁来说,也是相当弱的。
（2类线性的光谱。
谱带的尖锐原因是处于内层的4f电子受到5s2,5p6电子的屏蔽,受环境的影响较小。
（3谱带的范围较广。
在近紫外,可见区和近红外区内
的光谱。
都能得到稀土离子（Ⅲ
112 f—d跃迁光谱
4fn向4fn-15d的跃迁是组态间的跃迁。
这种跃迁是宇称选择规则允许的,因而4f—5d的跃迁是较强的;三价离子的吸收带一般在紫外区出现;由于5d能级易受周围离子的配体场影响,相对于f—f跃迁来说,谱带变宽。
113 电荷跃迁光谱
稀土离子的电荷跃迁光谱,是指配体向金属发生电荷跃迁而产生的光谱,是电荷密度从配体的分子轨道向金属离子轨道进行重新分配的结果。
镧系络合物能否出现电荷跃迁带
取决于配体和金属离子的氧化还原性。
一般在易氧化的配体
3+3+
和易还原为低价离子（Sm,Eu,Te3+,Yb3+和Ce4+的络合物光谱中易见到电荷跃迁带。
谱带的特点是有较强的强度和较宽的宽度。
基金项目:
广东省科技攻关重点项目（2002C60113;广州市天河区科技计划项目（2002XGP06;广东省自然科学基金项目（No1015012,
No.031518;教育部科学技术研究重点项目（No102113资助
作者简介:
郭周义,1965年生,华南师范大学激光生命科学研究所教授,博士生导师
301,23415,292,189nm
。
2 稀土离子的荧光性能
211 稀土的荧光光谱
在紫外线等高能射线的激发下,处在溶液或化合物中的三价稀土离子被激发,从基态跃迁到激发态,然后再从激发态返回到能量较低的能态时,放出辐射能而发光,这种光即为荧光。
稀土离子的荧光光谱也像吸收光谱一样,来自三个方面的跃迁:
f—f跃迁;5d—4f跃迁;电荷转移跃迁。
当一些络合物的配体不吸收紫外光时,其荧光的产生,可通过电荷跃迁或4fn-4fn-15d跃迁至相应的激发态,再以非辐射衰变至4fn组态的激发态,此激发态向低能态跃迁时,也可产生荧光。
212 紫外线激发产生荧光的物理过程[4]
络合物荧光的能量跃迁过程,一般可分三步来说明（跃迁过程见图1:
（1先由配体吸收辐射能,从单重态的基态S0跃迁至激发态S1,其激发能可以辐射方式回到基态S体荧光,或T2;（2,态（磷光,图中是稀土离子;（3的能量跃迁也有两种方式,,再至基态,或以辐射方式跃迁到较低能态,此时就产生荧光
。
Fig12 Charge2transfertransitionspectrumofEu3+halide
（1Eucl6-3;（EuBr6-3
335D0→7FJ的跃迁光谱,包括电荷转。
电荷转移跃迁光谱是配体向稀土离子的电荷转移态（4f壳层内发生电荷转移而产生的,5D0→7F1,7F2,7F4的荧光波长分别为590～596nm,
610～620nm,687～703nm。
而当用β2二酮体作Eu3+配位
体时,与电荷转移跃迁不同,配位体的三重态与Eu3+的5DJ态发生共振能量转移,而不是电子密度的重新分配。
Eu3+依靠配位二酮体的能量转移,可以得到强烈的Eu3+的5D0→
7
F2（610～620nm跃迁荧光。
我们的实验表明,依靠配体的能量转移获得的Eu3+的5
D0→7F2荧光强度远远大于由于电荷转移或4f→5d的跃迁吸收所得到的5D0→7F2的荧光强度。
4 TRFIA中Eu3+螯合物的光谱
我们在研究TRFIA方法的过程中,分别观察了标记化合物中,以及添加增强液后溶液中形成的Eu3+螯合物的吸收及荧光谱。
这两种螯合物的吸收带均在紫外区。
荧光增强
Fig11 Energylevelschemeoftheenergy2loss
procedureoftheexcitedstate
从这里得知,稀土离子长寿命荧光的产生,是先由配体
吸收能量,然后以非辐射方式,经三重态,传递给稀土离子,将稀土离子从基态跃迁到激发态,接着,处在激发态的离子,以辐射方式跃迁到低能态而发出荧光。
所以,要产生较强的荧光,选择合适的配体非常重要。
一般来说,当稀土离子的激发态与配体的三重态相当,或在其以下时,就可能由配体的三重态将能量转移给稀土离子,产生长寿命荧光。
经分析可知,易氧化的配体与易还原的稀土离子组成的络合物,易发生电荷转移跃迁。
Eu3+最易还原成Eu2+。
因
3+
此,在Eu的一些络合物的吸收谱中,可经常出现电荷转移跃迁[5]（参见图2。
电荷跃迁带的出现与位置,和配体性质
3+-有关。
Eu的Cl,Br-,I-的络合物的电荷跃迁带分别位于
Fig13 AbsorptionspectraofthefluorescentEu3+chelate
（L1C,Labellingchelate;E1L,Enhancementliquid
Eu3+螯合物的吸收在300～350nm区间表现出特殊的趋势
（参见图3。
至少说明,4f组态被激发的机制是复杂的。
（我们认为可能是依靠微弱的电荷转移或4f→5d的吸收,而且标记化合物中Eu3+的氧和氮的配位体不能起到转移激发能的作用
。
我们注意到这一点,是因为我们在实验中发现,这段波长的激发与5D0→7F2的特征荧光峰的出现及强度有着直接关系,说明此时的吸收及能量转移机制对Eu3+的5D0激发最为有利,300～350nm是激发配位二酮体的最佳波段,参见图4
。
Fig16 Fluorescencespectraofthelabelingchelate
Fig14 FluorescenceofthefluorescentEu3+chelate
5 TRFIA的时间分辨技术及荧光增强技术
的原理
稀土螯合物经紫外激发后产生的荧光,不但强度高,而且荧光衰变时间也长,大约10～1000μs,一般生物类样品的自然本底荧光的衰变时间只有几微秒,荧光寿命的大的差异,为采用时间分辨光谱技术提供了必要的条件。
TRFIA是时间分辨光谱技术与荧光增强技术和免疫分析技术的结合。
分析的开始,首先用Eu3+螯合剂标记抗体（或抗原,要求螯合剂要有双功能基团,一端螯合Eu3+,另一端螯合蛋白质。
常用的螯合剂有:
氨基苯基2EDTA,异硫氰酸盐2EDTA,12（P2苯双氮2EDTA,它们保证了免疫分析的稳定性,但是不能满足荧光检测的需要。
选择既有强烈的螯合能力,又有好的吸收及能量转移特性的螯合剂是十分困难的,因此在TRFIA方法中标记抗体和抗原与测量过程是分开进行的。
为了满足检测需要,在检测之前,须向标记物中添加一种低pH值的增强液,其中包含β2二酮体及32辛烷基磷化氢的氧化物等。
溶液中会形成含二酮体配位体的Eu3+螯合物。
当选择合适的激发波长（336～337nm时,二酮体能够被有效激发,使Eu3+发出5D0→7FJ（610～620nm的窄而强的特征荧光峰。
1987年,Lehn[6]发明了Eu离子的一种穴状化合物,由于这种穴状化合物很好地防止了水、氧及其他物质对铕离子荧光的猝灭效应,且具有良好的亲合性,Lehn和GerardMathis将它与XL665（一种稳定的allophycocyanin分子结合使用,促进了快速时间分辨荧光技术的发展。
铕离子与XL665之间通过共振能量转移的方式,产生特征性的荧光,且荧光产生的量子效率高,促进了快速均相时间分辨荧光技术的发
图4显示的是荧光增强Eu3+螯合物的荧光谱。
我们连续改变激发波长进行观察,在336～337nm处得到了特征荧光峰（610～620nm的最大值,即获得了最佳增强效果（见图5。
这主要是因为:
336～337nm的波长有效地激发了配位二酮体的单态,并且在能量转移过程中,能级间的配合最为恰当
。
Fig15 Thehighesteffectoffluorescenceenhancement
bythefluorescentEu3+chelate
当我们选用不同波长的光（≥300nm激发标记化合物中的Eu3+螯合物时（参见图6,发现Eu3+的5DJ得到激发,在荧光谱图上没有出现5D0→7FJ的特征荧光峰,直到波长改变到220～280nm时,才发现了微弱的4f组态的窄峰,但几乎被强大的背景荧光所掩盖,参见图6中第6条曲线。
这
第5期 光谱学与光谱分析599
展。
其作用示意图见图7。
图7的上部分说明了此种铕离子螯合物的测量法。
铕离子吸收337nm的激发光后,通过共振能量转移,传给XL665,发出665nm的长寿命荧光,经一段时间的延迟后,再记录665nm荧光的强度,从而可消除短寿命背景荧光的干扰。
图7的中间部分说明,当XL665为自由状态或与铕离子离的较远时（一般有效距离不大于915nm[6],它也发射665nm的荧光,但是荧光的衰变时间很短,可通过时间延迟克服掉。
图7的下部分说明,当铕离子化合物未与XL665结合时,其荧光为620nm的长寿命的荧光,通过波长分离与665nm的荧光区别开来。
6语
也是20世纪末配基技术的重大进展,测定、抗原到激素、药物,十分广泛,已引起国内外
[7,8]
科学工作者的重视。
参
[1] PettersonKetal.Clin.Chem.,1983,29:
60.[2] EskolaJuetal.Clin.Chem.,1983,29:
1777.
[3] MichelsenB.AnalysisandApplicationofRareEarthMaterials.Oslo:
Universitetsforlaget,1973.
[4] ZHANGRuo2hua（张若桦.LanthanideChemistry（稀土元素化学.TianjinPubhishingCompanyofScienceandTechnology（天津科学技术出
Fig17 Principlesof考文献
版社,1987.
[5] RyanJL.J.Phys.Chem.,1966,70:
2845.
[6] DietrichB,SauvageJ2P.TheNobelAwardGoestoCrownEthers,CryptandsandOtherHost3GuestMolecularSystems.NewJ.Chem.,
1987,12:
8.
[7] TIANZhen,GUOZhou2yietal（田 振,郭周义等.ActaLaserBiologySinica（激光生物学报,2002,11（4:
290.[8] TIANZhen,GUOZhou2yi（田 振,郭周义.J.OptoelectronicsLaser（光电子・激光,2002,13（11:
1998.
SpectroscopicEvaluationofTime2ResolvedFluoroimmunoassay
GUOZhou2yi,TIANZhen,JIAYa2li
InstituteofLaserLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou 510631,China
Abstract ThelanthanidetrivalenceionanditschelatesareusedformarkingsubstanceinTime2ResolvedFluorescenceImmunoassay
（TRFIA,markingprotein,hormone,antibody,nucleicacidprobeorbiologicalivecell,tomeasuretheconcentrationoftheanalysissubstanceinsidethereactionsystemwithtime2resolvedfluorometryafterthereactionsystemoccurred,andattainthequantitativeanalysis’spurpose.TRFIAhasthereforebecomeakindofnewandmoresensitivemeasurementmethodafter
radioisotopemarking,enzymaticmarking,chemiluminescence,electrochemiluminescence,primarilydependingonthespecialphysicsandchemistrycharacter2isticsoflanthanidetrivalenceionanditschelates.Inthispaper,theresultofspectroscopicevaluationofeuropiumtrivalenceionanditschelate,andtheprincipleoftime2resolvedtechnologyandfluorescence2enhancedtechnologyarereported.Atthesametime,theexper2imentshowsthattheexcitationwavelengthchosenbetween336and337nmbenefitstheexcitationandtheenergytransferofchelatediketoneofeuropiumtrivalenceion.
Keywords Immunoassay;Fluorescence2enhancedtechnology;Time2resolvedspectroscopictechnology;Europiumtrivalenceion
chelate
（ReceivedMarch26,2003;acceptedJune28,2003
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