酶联免疫吸附实验ELISA操作规则新手适用.docx

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酶联免疫吸附实验ELISA操作规则新手适用

酶联免疫吸附实验ELISA－－操作规则（新手适用）

一、实验目的

酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatictechniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）--待测抗体（抗原）--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

二、实验原理

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm403nm1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml计算是HRP的A（1cm403nmmg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（ＲeinheitZahl）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。

用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

（二）酶与底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。

是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物

酶

底物

显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶

邻苯二胺

橘红色

492*

四甲替联苯胺

黄色

460**

氨基水杨酸

棕色

449

邻联苯甲胺

兰色

425

2，2'-连胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐

蓝绿色

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐（PNP）

黄色

400

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐

红色

500

葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

黄色

405，420

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰

深蓝色

β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）

荧光

360，450

硝基酚半乳糖苷（ONPG）

黄色

420

* 终止剂为2mol/LH2SO4

**终止剂为2mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。

可催化下列反应：

HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+AAH2——为无色底物，供氢体；A——为有色产物。

（三）ELISA常用的四种方法

1．直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面；

加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

加底物。

底物的降解量＝抗原量。

2．间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面；

加抗体，形成抗原-抗体复合物；

加酶标抗体；

加底物。

测定底物的降解量＝抗体量。

3．双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;

加抗原，形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;

加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;

加底物。

底物的降解量＝抗原量。

4.竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面;

（1）加入酶标抗原；

（2），（3）加入酶标抗原和待测抗原；

加底物。

对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三、仪器和材料

1.聚苯乙烯微量细胞培养板（平板，40，96孔）。

2.酶联免疫检测仪

3.辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，工作稀释度1:

1000。

4.包被液:

：

0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，　Na2CO30.15克，NaHCO30.293克，蒸馏水稀释至100ml。

5.稀释液：

0.01mol/LpH7.4PBS--Tween--20，４℃，保存.NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，Tween—20，0.5ml.蒸馏水加至1000ml。

6.洗涤液：

同稀释液

7.封闭液：

0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4PBS。

8.邻苯二胺溶液（底物）：

临用前配制0.1M柠檬酸（2.1g/100ml），6.1ml0.2MNa2HPO4.12H2O　（7.163g/100ml）　6.4ml，蒸馏水12.5ml，邻苯二胺10mg，溶解后，临用前加30%H2O240微升。

9.终止液：

2mol/LH2SO4。

四、操作步骤

1.包被抗原：

用包被液将抗原作适当稀释，一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

2.洗涤：

倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3.加封闭液200微升，37℃放置一小时。

4.洗涤同2。

5.加被检血清：

用稀释液将被检血清作几种稀释，，每孔200微升。

同时作稀释液对照。

37℃放置2小时。

6.洗涤同2。

7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200微升，放置37℃1小时。

8.洗涤同2。

9.加底物：

邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。

10.加终止液：

每孔50微升。

11.观察结果：

用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

流式细胞术FCM介绍及简易操作步骤－－新手适用

一、流式细胞术概述

流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集（分选）某一亚群细胞，分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:

Becton-Dickinson公司（简称B-D公司）和BECKMAN-COULTER公司。

流式细胞仪主要有两型:

临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

B-D公司最新产品为FACSVantage和FACSCalibur。

BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。

二、流式细胞仪主要技术指标

1.流式细胞仪的分析速度：

一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。

2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度：

一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差

＞5%即可区分。

3.前向角散射（FSC）光检测灵敏度：

前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。

4.流式细胞仪的分辨率：

通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测

量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

5.流式细胞仪的分选速度：

一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

三、流式细胞仪主要构造和工作原理-----流动室及液流驱动系统

流式细胞仪主要由以下五部分构成:

①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。

流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。

流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力， 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。

见图12.1流动室示意图。

流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。

小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。

图12.1流动室示意图（采自Coulter Training Guide）

四、流式细胞仪主要构造和工作原理----激光光源及光束形成系统

流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488ηm，此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633ηm）和/或紫外激光管。

流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。

在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束（22μm×66μm），在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

五、流式细胞仪主要构造和工作原理-----光学系统

流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。

流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。

滤光片主要有三类：

长通滤片（LP）--只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片（SP）-- 只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片（BP）-- 只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管（PMT），如接收绿色荧光（FITC）的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525， 接收色橙红色荧光（PE）的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575， 接收红色荧光（CY5）的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。

见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。

六、流式细胞仪主要构造和工作原理   信号检测系统

当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号，散射光分为前向角散射（Forward Scatter， FS）和侧向角散射或900散射（Side Scatter， SS），散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种，一种是细胞自发荧光它一般很微弱，一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光，荧光信号较强，这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由，以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。

前向角散射（FS）反映被测细胞的大小，它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管（PMT） 接收并转变为电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，他们分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管，它的发射光波488ηm，氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。

488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（叶绿素蛋白）、ECD（藻红蛋白-得克萨斯红）等。

他们的激发光和发射光波长分别是：

             激发光波长（ηm）       发射光峰值（ηm）

FITC            488                      525（绿）

PE              488                      575（橙红）  

PI              488                      630（橙红）

ECD             488                      610（红）

CY5             488                      675（深红）

PreCP           488                      675（深红）

各种荧光信号由各自的光电倍增管（PMT） 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。

七、流式细胞仪信号存储、显示、分析系统

（一）信号存储

存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode（列表排队）方式存入的，采用List mode方式有两大优点:

①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。

（二）信号显示和分析

由于List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直

方图（图12.3）、二维点阵图（图12.4，12.5）、等高线图（图12.8）和密度图（图12.7）。

1．单参数数据显示和分析  细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。

见图12.3一维直方图，图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）。

2.双参数数据显示和分析  细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

如图12.4二维点阵图，是正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞、粒细胞很明显地分为3群，可以很容易地圈“门”（ Bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图（X轴:

 SSC ，Y轴:

FSC Z轴:

细胞数）更清楚地表明这一点。

图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光（FITC和RD1）双参数数据显示，横坐标和纵坐标均是对数的，横坐标代表FITC，纵坐标代表PE，图中已设定适当的“门”（十字门），十字门的D1、D2、D3、D4门分别代表PE单阳性细胞、PE和FITC双阳性细胞 、阴性细胞、FITC单阳性细胞。

仪器的计算机就会给出两种荧光测定值（包括阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度）。

图12.7和图12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。

3．三参数数据显示和分析  细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。

见图12.9 prism，图12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图，图中给出CD3、CD4、CD8组合的各种结果，如T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-）为42.0%，如T抑制细胞（CD3+CD4+CD8-）为17.4%。

图12.5两种荧光的二维点阵图（采自Coulter Operaters Guide）

图12.7. 双参数数据的密度图（采自Coulter Operaters Guide）

图12.6假三维地形图和二维点阵图（采自Coulter Operaters Guide）

图12.8双参数数据的等高线图（采自Coulter Operaters Guide）

图12.9 分光图（prism）

八、流式细胞仪主要构造和工作原理------细胞分选系统

如在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动，使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴， 每秒钟形成液滴上万个。

每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中，不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中，从而实现了分选。

分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。

九、流式细胞仪的简易样品制备和操作步骤

活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

（一）操作步骤――特别简单

制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液）FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7天）

（二）试剂和器材

1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3.10％FCSRPMI1640，DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。

4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项

有二种标记方式：

直接免疫荧光标记法，直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入）。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

间接免疫荧光标记法，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.最小化非特异性结合的方法

a．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

b．细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

c．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。

加适量正常兔血清也可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性

d．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。

这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。

通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。

此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。

这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。

e．使用F（ab’）2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。

大多数的第二抗体的F（ab’）2片段容易利用。

而第一抗体的F（ab’）2片段一般是不能利用或很难制作。

因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。

在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。

f．其它：

已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。

为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

附:

1.DPBS（×10，贮存液）　NaCl80g　KCl2g　蒸馏水加至1000ml　　Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释　KH２PO４2g

2.洗涤液　DPBS　900ml　FCS50ml（终浓度　5％）　4％NaN３50ml（终浓度0.2％）

固定液　DPBS　1000ml　葡萄糖　20g（终浓度2％）　甲　醛　10ml　NaN３　0.2g（终浓度0.02％）

免疫荧光（IF）细胞化学染色方法

一、标本制作

可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法

（一）直接法

1．染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：

8或1：

16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。

2．洗片倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。

3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检

4．对照染色

①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。

②染色抑制试验（一步法）：

将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。

结果应为阴性。

为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。

此法结果较二步法稳定。

③类属抗原染色试验，前面已作叙述。

直接法比较