实时荧光定量PCR--PPT3.pptx

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LOREMIPSUMDOLORLO,实时荧光定量PCR,1.定义原理2.方法步骤3.应用领域4.前景展望,实时荧光定量PCR的内容:

定义原理,一、PCR

（一）PCR的定义PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

（二）原理PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成：

定义原理,模板DNA的变性：

模板DNA经加热至9095一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5060，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：

DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,定义原理,二、实时荧光定量PCR

（二）定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）原理1、Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。

C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是:

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.2、扩增曲线反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化。

线性扩增曲线呈现“S”型，分为四个阶段，PCR反应的动力学过程可以视作引物、模板、酶三者的随机碰撞。

定义原理,3、荧光阈值的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的设置是3-15个循环的荧光信号（基线信号）的标准偏差的10倍，即：

threshold=10SDcycle3-154、Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如下图所示）。

因此，只要获得未知样品的的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

定义原理,实时荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,方法步骤,实时荧光定量PCR的方法非特异性荧光标记：

SYBRGreen法特异性荧光标记：

TaqMan法MolecularBeacon法,方法步骤,一、PCR反应的建立TaqMan法1、样品的制备2、定量PCR引物及探针的合成3、标准品的制备-质粒或纯化后的PCR产物4、通道的选择及增益的选择5、标准曲线的建立6、加样时的操作7、阈值的设定8.熔解曲线分析,方法与步骤,二、操作流程1、确立实验方案2、样品制备3、设计引物及探针4、预实验5、标准品及标准曲线的建立6、定量PCR检测7、分析数据,方法步骤,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团（Reporter,R），如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团（Quencher,Q）探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针,方法步骤,TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,方法步骤,1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70，30bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60。

2、反应参数的确定：

一般为：

94，10-20，60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60最高），也可通过温度梯度优化退火温度、72，45S。

3、优化引物和探针浓度：

获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值引物浓度：

50-900nM探针浓度：

50-250nM4、其他与常规PCR相同,优点,1对目标序列的高特异性-阴性结果确定2设计相对简单-与目标序列某一区域互补3重复性比较好,缺点,1只适合一个特定的目标2委托公司标记，价格较高3不易找到本底低的探针,方法步骤-TaqMan法优缺点,应用领域,TL988型实时荧光定量PCR仪应用领域临床疾病诊断：

各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核等。

动物疾病检测：

禽流感、新城疫、炭疽芽孢杆菌等。

食品安全：

食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

科学研究：

医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

应用行业：

各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

前景展望,实时荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。

多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。

自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔，令人欣喜。