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a淀粉酶发酵的生产工艺

武汉轻工大学

设计α-淀粉酶的发酵生产工艺

系部食品科学与工程学院

专业粮食工程

班级粮工1002

姓名郑开旭

学号100107502

指导教师易阳

2013年6月9日

设计α-淀粉酶发酵的生产工艺

摘要:

α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

本次设计的淀粉酶发酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的生产工艺。

关键词：

α-淀粉酶；工艺设计；发酵

正文:

α-淀粉酶的生产工艺

1α-淀粉酶的生产方法

1.1生产方法的选择

枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。

我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。

该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。

∙固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶

将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0.5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。

麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。

∙深层发酵法生产α-淀粉酶

斜面菌种制法同前。

将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。

然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。

当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。

中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。

停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。

而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。

冷却到35℃，加入硅藻土为助滤剂过滤。

滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼于40℃烘干，磨粉而成。

按此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。

对于固体发酵有以下缺点：

1.限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合于真菌。

2.在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。

3.固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体发酵，pH值、湿度、基质浓度不易调控，Biomass不易量测，每批次发酵条件不易一致，再现性差。

4.不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。

5.由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。

6.固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。

7.萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。

而对于发酵罐深层培养具有生产周期短、产量高、效益大等优点故选用层发酵法生产α-淀粉酶。

1.2α-淀粉酶培养基的制作

（1）培养基的类型

培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。

微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。

（2）孢子培养基

孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。

对孢子培养基的要求：

①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。

α-淀粉酶的孢子培养基配置如下：

将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20min。

（3）种子培养基

种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。

对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

α-淀粉酶的种子培养基的配置：

将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基（pH7.1～7.2），在0.1MPa蒸汽灭菌20min。

（4）发酵培养基

发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。

α-淀粉酶的发酵培养基配方是：

麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h.

本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。

设计流程如下：

孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐

（1）孢子制备

将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。

（2）种子制备

将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O5mg/L，琼脂2%，pH6.7～7.0），37℃培养3天。

然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。

此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。

（3）发酵罐培养

培养基的配制：

用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·12H2O0.8％、（NH4）2SO40.4％、CaCl20.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至6.5～7.0。

发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。

培养条件为：

温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h为1：

0.48vvm，20h后1：

0.67vvm，培养时间为28～36h。

（二）此培养基的制备

1.培养基的制备与灭菌

发酵培养基：

蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O0.25g，CaCl2.2H2O0.1g，H2O500mL，pH7.0。

分装于100mL锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min。

2.接种与产酶培养

接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。

37℃振荡培养48h。

3.离心

将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min离心10min，除菌体，上清液即为α－淀粉酶粗酶液。

2α-淀粉酶的菌种选育

α-淀粉酶生产：

以枯草芽孢杆菌14140为出发菌株,经亚硝基胍反复多次处理和筛选生产α-淀粉酶。

分离纯化：

以CTAB/正丁醇/异辛烷构成反胶团系统,通过反胶团萃取方式纯化精制α-淀粉酶。

最佳反应条件为：

萃取温度40℃，水相组成为NaCl0.03mol/L，pH12.0，有机相：

无机相=1∶2，振荡时间10min；反萃取最佳条件为：

温度60℃，水相组成为KCl3mol/L，pH4.0，有机相∶无机相=2∶1，反萃取振荡时间10min。

在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后，α-淀粉酶的萃取率最高可达90.78%。

2.1菌株与培养方法

2.1.1培养基

BY斜面培养基每100g含可溶性淀粉1g，牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏0.2g，NaCl0.5g，琼脂2g.BY发酵培养基每100g含可溶性淀粉5g，牛肉膏1g，蛋白胨1.5g，酵母膏0.2g，NaCl0.5g，CaCl21g。

调节pH7.0，经121℃，灭菌30min，备用。

2.1.2仪器设备

全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。

2.2实验方法

2．2．1细菌的分离与初步鉴定：

将土壤系列稀释，把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

2．2．2紫外线诱变育种：

取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

2.3诱变方法以及变异菌株的筛选

①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（μg/ml），在一定pH值的缓冲液中30℃恒温振荡处理1~4h。

③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30℃培养36h。

⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。

倒入200mm×300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37℃，24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc，用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。

把各种斜面菌株经活化培养，接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。

将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活较高的产酶菌株。

经菌种诱变选育α-淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG反复多次处理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育α-淀粉酶高产菌株。

经NTG反复多次处理，α-淀粉酶活力有较大幅度提高。

在经5次NTG处理之后，其变异株α-淀粉酶活达到34200（U/ml），较出发菌株提高了4.2倍以上，说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。

经NTG处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差,必须经反复多次单菌落分离和摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。

3α-淀粉酶分离纯化：

α-淀粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法

3.1α-淀粉酶的分离和纯化：

高纯度α－淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。

分离纯化α－淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。

要得到高纯度α－淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。

盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分离纯化的主要方法。

通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性α一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸α一淀粉酶，纯化倍数为11.7，活力回收率为29.8%。

但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。

反胶团萃取具有选择性高、正萃与反萃可同时进行、分离与浓缩同步进行、操作简单和易于放大等优点，并能有效防止生物分子变性失活。

以CTAB/正丁醇/异辛烷构成反胶团系统，通过反胶团萃取方式纯化精制α-淀粉酶。

最佳反应条件为:

萃取温度40℃，水相组成为NaCl0.03mol/L，pH12.0，有机相：

无机相=1：

2，振荡时间10min；反萃取最佳条件为:

温度60℃，水相组成为KCl3mol/L，pH4.0,有机相：

无机相=2：

1，反萃取振荡时间10min。

在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后，淀粉酶的萃取率最高可达90.78%。

双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。

应用双水相系统PEG／磷酸盐分离纯化α－淀粉酶，增加PEG浓度有助于酶富集上相。

同样用PEG／磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温α一淀粉酶，分配系数及回收率分别为4.8和87％。

采用PEG（聚乙二醇）／硫酸铵双水相体系，进行分离纯化α－淀粉酶，结果表明，在室温下由PEG和硫酸铵所组成的双水相体系，对α－淀粉酶的回收率可达94.84％，分配系数可达17.10。

双水相技术有着溶液粘度高、分相时间长，易造成界面乳化等缺点，给实际操作带来很多问题。

为了获得高纯度的α一淀粉酶，开始人们利用软基质的离子交换色谱和亲和色谱分离纯化了α-淀粉酶的粗酶提取液。

但是，软基质色谱介质的机械强度小，受压易变形，分析速度慢，分离效率低，柱寿命短，固定相对PH、离子强度和压力非常敏感，反复使用时配体碎片容易脱落。

由于以上缺点，软基质色谱有逐渐被硬基质色谱取代的趋势。

在硬基质色谱应用方面，李华儒等首次合成一种对α一淀粉酶具有特异亲和能力的色谱介质，并成功地分离纯化了工业粗酶，获得了高纯度产品，其活性回收率>88%，Kato等也用高效疏水色谱纯化了α-淀粉酶粗品，回收率为90%。

之后其采用高效液相离子交换色谱纯化α一淀粉酶很好地分离了α一淀粉酶粗品，其活性回收率高达96%，比活性达388μ/mg蛋白质。

此法的研究成功为大规模制备高纯度α一淀粉酶提供了一个新工艺路线。

3.2实验方法

（1）反胶团系统的配置将适当比例的正丁醇和异辛烷加入比色管，摇匀。

再加入适量CTAB，放入加热套中加热溶解，摇匀，使其均匀分布于有机相，得到澄清透明稳定的反胶团系统。

（2）前萃取　将α-淀粉酶溶解于不同缓冲液中，稀释，并用4层洁净纱布滤清。

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH（pI），构成初始水相。

将反胶团相和水相置于50mL带塞三角烧瓶中，在振荡器上剧烈摇晃后（250r/min,10min），倾入离心管，进行离心（3500r/min,5min），用滴管小心地将两相分开取上层有机相待用。

（3）反萃取　用去离子水配制适当pH值（pH

用滴管小心地将两相分开，下层水相即为纯化的淀粉酶。

3.2.1分析和测试方法

（1）α-淀粉酶活力的测定，采用国标QB/1803—93，对萃取前的粗酶以及萃取后的精制酶的酶活力进行测定，依据所附“吸光度和淀粉酶酶浓度对照表”。

将吸光度换算为酶活浓度c，进而求出酶活D660。

按下式计算：

D660=c×n

式中：

c———测试酶液浓度，u/g；　　

　n———样品的稀释倍数，g/mL。

平行试验相对误差不得超过2%。

（2）α-淀粉酶萃取率E：

按下式计算：

E=反萃取水相中酶的总活力分相前加入的酶总活力×100%

工艺流程图如下

5.结论：

提高B.subtilisα-淀粉酶酶活可通过打破基因调控机制和优化环境因素协同作用来实现。

经NTG反复多次对B.subtilis菌株进行诱变处理，在一定程度上打破了酶合成调控机制和酶分泌调节机制，从而获得了α-淀粉酶高产变异株。

CTAB/正丁醇/异辛烷反胶团系统萃取工业级α-淀粉酶的最佳条件为：

萃取温度40℃，水相组成为NaCl0.03mol/L，pH12.0，有机相∶无机相=1∶2，振荡时间10mi；反萃取温度60℃，反萃取水相组成为：

KCl3mol/L，pH4.0，有机相：

无机相=2：

1，反萃取振荡时间10min。

在上述条件下,经过一个萃取与反萃取循环后，α-淀粉酶的萃取率最高可达90.78%。

反胶团萃取分离酶具有单级萃取率高、能实现连续操作等优点，可望发展成为一种生物产品分离的新方法。

6.参考文献

食品生物技术导论