式中:
----平均值;
S----标准差;
n----测量次数;
xi----指定参数第i次测量值。
(八)生物安全性(如适用)
校准品、质控品如含人源性成分,用经过国家批检合格的以下三种体外诊断试剂盒对该试剂盒的校准品、质控分别进行检测:
a)人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒;b)丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒;c)乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒,HIV抗体、HCV抗体和HBsAg应为阴性。
11.【注意事项】应至少包括以下内容:
(1)有关人源组分(如有)的警告,如:
试剂内质控品或其他可能含有人源物质的组分,虽已经通过了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等项目的检测,但截至目前,没有任何一项检测可以确保绝对安全,故仍应将这些组分作为潜在传染源对待。
(2)建议实验室的环境要求,如温度、湿度、电磁环境等。
(3)对采集样本的要求,建议使用新鲜血液,不建议使用高脂乳糜样、黄疸、高类风湿因子样本,勿使用溶血样本,明确样本的处理办法。
(4)对所有样本和反应废弃物都视为传染源进行处理。
(5)其他有关C反应蛋白定量检测试剂盒的注意事项。
(三)拟定产品标准及编制说明
拟定产品标准应符合《体外诊断试剂注册管理办法》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》的相关规定。
另外,对于国产试剂,应参考《中国生物制品规程》(2000年版),将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定、校准品制备溯源过程、质控品的制备赋值过程等内容作为附录附于标准正文后,并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。
作为定量检测试剂盒,C反应蛋白产品的注册检测应主要包括以下性能指标:
外观检查、物理检查、准确度、线性范围、分析灵敏度/检出限(空白限)、精密度(批间、重复性)、校准品溯源性、质控品测量准确度及均一性、生物安全性(如适用)等。
如果拟申报试剂已有相应的专用国家/行业标准或相应方法学的通用标准要求发布,则企业标准的要求不得低于上述标准要求。
(四)注册检验
根据《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》要求,首次申请注册的第二类产品应该在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行注册检测。
由于C反应蛋白目前尚无国家标准品,申请人应建立自己的参考品体系并提供相应的内部参考品。
(五)主要原材料研究资料
1.试剂盒所用抗体的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料。
如抗体为申请人自制,则应详述抗体的名称及生物学来源,申请人对该抗体技术指标的要求(如外观、纯度、蛋白浓度、效价等),确定该抗体作为主要原材料的依据;如抗体为申请人外购,则应详述抗体的名称及生物学来源,外购方名称,提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书,详述申请人对该抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。
2.其他主要原辅料的选择及验证资料,如包被板、反应缓冲液等,申请人应详述每一原辅料技术指标的要求以及确定该原辅料作为主要原辅料的依据。
若为外购,应详述每一原辅料的外购方名称并提交外购方出具的每一原辅料性能指标及检验证书。
3.企业内部参考品的原料选择、制备、定值过程及试验资料。
(六)主要生产工艺及反应体系的研究资料
1.主要生产工艺介绍,可以流程图方式表示,并简要说明主要生产工艺的确定依据。
2.产品反应原理介绍。
3.抗体包被/致敏工艺研究:
申请人应考虑如包被液量、浓度、时间、温度等指标对产品性能的影响,通过试验确定上述指标的最佳组合。
4.实验体系反应条件确定:
申请人因考虑反应时间、反应温度、pH值等条件对产品性能的影响,通过试验确定上述条件的最佳组合。
5.体系中样品加样方式及加样量确定:
申请人应考虑样品加样方式、加样量对产品检测结果的影响,通过实验确定最佳的加样方式及加样量。
如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测,申请人还应对可用于样本稀释的物质或处理方法进行研究,通过试验确定最终选择的用于样本稀释的物质或处理方法。
确定反应所需其他物质用量(标准品、酶标物、底物等)的研究资料。
固相载体、显色(发光)系统、酶作用底物等的介绍。
6.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。
(七)分析性能评估资料
企业应提交原厂在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料,包括具体研究方法、实验数据、质控标准、统计分析等详细资料。
对于C反应蛋白定量检测试剂盒建议至少选择3批产品对以下分析性能进行研究:
分析灵敏度、准确度、特异性、线性范围、精密度(批间、批内)等指标,具体研究方法建议参考相关指导原则。
对于适用多个机型的产品,应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。
1.准确度
(1)与企业内部参考品的比对研究
使用已溯源的企业内部定值参考品进行验证,重点观察检测结果的偏差情况。
(2)回收试验
用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力,结果用回收率表示。
通常对样本进行2~3次回收试验,取平均值即平均回收率。
回收试验注意事项:
加入的标准液体积一般应小于样本体积的10%;
尽量使加入标准液后样本中的被测物浓度接近医学决定水平;
标准物浓度应该足够高,以得到不同浓度的回收样本;
注意基质效应,尽量采用与临床待测样本接近的基质。
(3)方法学比对
采用参考方法或国内/国际普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法,与拟申报试剂同时检测一批病人样品,从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。
如偏倚很小或在允许的误差范围内,说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符,对同一份临床样本的医学解释,拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结果。
在实施方法学比对前,应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估,只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。
方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。
注:
C反应蛋白目前尚无国家参考品,以后国家参考品若建立,优先采用
(1)方法;本产品不建议采用方法
(2)衡量准确度。
2.分析灵敏度
分析灵敏度的确定常使用同批号试剂对零浓度校准品(或样品稀释液)进行至少20次重复检测,以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(
+2SD)。
3.线性范围
建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似,理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清,且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。
建立一种定量测定方法的线性范围时,需在预期测定范围内选择7~11个浓度水平。
例如,将预期测定范围加宽至130%,在此范围内选择更多的浓度水平,然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系,可发现最宽的线性范围。
4.精密度
测量精密度的评估应至少包括两个浓度水平的样本进行,两个浓度包括医学决策点附近的数据、报告范围上下限附近的浓度值,通常选用该检测指标的正常参考值(范围)附近和异常高值样本。
两个浓度都选用高值样品,可能致CV偏小,也不能选用接近最低检出限的样品,可能致CV偏大。
对hsCRP,其中一个水平应处于美国心脏协会/美国疾病预防控制中心(AHA/CDC)给出的低风险类的临床节值(1.0mg/L),其CV应≤10%;中间水平应处于检测范围的中点;第三个水平应处于检测上限的附近。
5.分析特异性
(1)交叉反应:
易产生交叉反应的其他抗原、抗体等的验证情况;
(2)干扰物质:
样本中常见干扰物质对检测结果的影响,如高脂、黄疸、类风湿因子等干扰因子的研究(结果应量化表示,禁用轻度、严重的模糊表述);
(3)药物影响:
常见相关治疗药物对检测结果的影响。
6.钩状(Hook)效应(如有):
说明不会产生Hook效应的浓度上限或相关研究,如需稀释,应注明对稀释液的要求、最佳或最大稀释比例。
(八)参考值(参考范围)确定资料
参考值(范围)确定所采用的样本来源、确定方法及详细的试验资料。
建议参考CLSI/NCCLSC28-A2。
(九)稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容,申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。
前者主要包括实时稳定性(有效期)、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究,申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。
稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。
对于实时稳定性研究,应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
(十)临床试验资料
1.研究方法
选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂,采用拟申报产品(以下称考核试剂)与之进行对比试验研究,证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。
建议企业尽量选择方法学相同、线性范围及精密度等性能接近的同类试剂作为参比试剂。
2.临床研究单位的选择
(1)第二类产品申请人应当选定不少于2家(含2家)省级卫生医疗机构开展临床试验。
(2)临床研究单位应有能力提供临床评价所需的各类样本,实验操作人员有足够的时间熟悉检测系统的各环节(仪器、试剂、质控及操作程序等),熟悉评价方案。
在整个实验中,考核试剂和参比试剂都应处于有效的质量控制下,定期对仪器进行校准,最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
(3)不同的临床单位应使用同一批考核试剂进行临床试验,以便对数据进行科学客观的统计分析。
3.临床试验方案
临床试验实施前,研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑,设计科学合理的临床研究方案。
各临床研究机构的方案设置应基本一致,且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施,不可随意改动。
整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成,申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外,不得随意干涉实验进程,尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准,任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。
在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法及样本随机分配以保证试验结果的客观性。
对于新试剂的动态监测研究,应在方案中明确前后两次浓度变化有临床意义的标准。
临床试验中所涉及的样本类型应与产品说明书一致,且每种样本类型例数的选择应符合基本的统计学要求。
各研究单位选用的参比试剂及所用机型应一致,以便进行合理的统计学分析。
4.临床病例选择
(1)临床试验样本量的确定:
申请人或临床研究者应根据产品临床使用目的,与该改产品相关疾病的临床发生率确定临床研究的样本量。
在符合指导原则有关最低样本要求的前提下,还应符合统计学要求。
①临床研究的总样本数至少为200例。
②应考虑样本量的分布。
样本量的选择应符合统计学及相关指导原则的要求。
③样本浓度应覆盖考核试剂检测范围,尽可能均匀分布。
尽可能使30%样本的测定值处于参考区间以外,但在测量范围内。
另外,建议在临床试验中选择部分含干扰物质的标本进行对比研究,包括高脂、溶血、黄疸的样本、类风湿因子阳性样本,易共存的其他急性炎症时相因子同时升高的患者标本,以从临床角度验证试剂的特异性。
5.统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法,如相关分析、线性回归、受试者工作特征(ROC)曲线分析等。
对于对比实验的等效性研究,最常用是对考核试剂和参比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析,应重点观察相关系数(r值)或判定系数(R2)、回归拟合方程(斜率和y轴截距)等指标。
结合临床试验数据的正/偏态分布情况,建议统计学负责人选择合理的统计学方法进行分析,统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。
在临床研究方案中应明确统计检验假设,即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
6.结果差异样本的验证
在数据收集过程中,对于两种试剂的检测结果有明显差异的样本,应采用临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行验证试验,同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。
7.临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求,临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完