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血液病材料细胞遗传学

恶性血液病的细胞遗传学

中国医学科学院中国协和医学大学血液学研究所血液病医院

刘世和

一、背景

染色体发展历史

染色体检查在恶性血液病中的应用价值

国内外发展动态

染色体分析发展历史

1960-1971：

非显带时期

1971-1980：

显带、高分辨

1980-至今：

与分子生物学相结合时期，分子细胞遗传学（FISH）

意义

诊断与分型

疗效判断

验证移植成功与否或确定白血病的复发及其来源。

预后分析与指导治疗

查找新的致病基因，探讨发病机制

国内外发展动态

国外：

广泛开展，白血病与淋巴瘤必查项目

国内：

相对薄弱

原因

技术

劳动强度大

价格

患者经济

开展染色体检查要素

技术

合理的价格

规模化：

降低成本，提高效率，缩短报告时间

二、人类细胞遗传学命名

根据1995版人类细胞遗传学国际命名体制，正常核型男：

46，XY；

女：

46，XX。

异常核型包括体质性和获得性：

体质性异常；获得性异常

表1核型命名常用的缩写符号

染色体倒位（inv）

指同一染色体上的两个断点之间的片段发生180º旋转，如发生于单一臂内称为臂内倒位，发生于两臂称臂间倒位。

染色体重复（dup）

在一个染色体的某一位点上重复一段染色体片段。

插入（ins）

*包括2个染色体之间的插入和一个染色体内的插入。

2个染色体之间的插入为插入易位，接受插入片段的染色体总是列于前面，而提供易位片段的染色体列于次。

*一个染色体内的染色体插入可分为正向插入与反向插入。

等臂染色体（iso）

指一条染色体含有完全相同的臂。

易位（t）：

至少2个染色体之间发生的遗传物质的互换。

平衡易位和不平衡易位

两条染色体之间的易位描述方式为按染色体由小到大的排列顺序

易位：

3个染色体以上

罗伯逊易位（rob）

发生于D组或/和G组端着丝粒染色体易位，为两个长臂对接。

Rob（14;21）

缺失（del）

在某一个染色体上丢失部分遗传物质；分为中间缺失和末端缺失，如5q-

增加（add）

表示在某一染色体上获得来源不明的遗传物质，通常代表在染色体的末端增加。

15q+

区带的命名

区的定义是一个染色体上位于两个相邻的界标之间的区段。

带则是根据染色体上染色强度的强或弱与相邻形成反差而划分，每一条带可再分为亚带。

书写方式

书写方式：

①染色体号数，②臂的符号，③区号，④带，⑤小数点，⑥亚带

如1p33.11读作：

1号染色体短臂3区3带1亚带1

克隆的定义

来自一个细胞的细胞群体称之为一个克隆，

通常指具有相同或近似的异常染色体组成的一群细胞。

标准为：

至少2个细胞具有相同的染色体增加或结构异常，或至少3个细胞有一致的染色体丢失。

克隆性异常是恶性疾病的标志。

模式图

◆

核型描述

①众数：

即一个中期分裂相实际的染色体数46,47,55,等

②性染色体：

XX或XY

③按染色体的序号排列由小到大1-22，

④注明分析的中期数

如：

49,x,-x,+1,-5,t（5;12）（q22;p13）,-7,del（7）（q32）,t（7;10）（p11;q13）,+8,9,+r,+mar[19]

克隆描述

①单一克隆：

47，XY,+8[20]

②克隆演变所致相关克隆：

干系列第一，然后按演化先后顺序由简单到复杂依次列出.如：

46，XY,t（8;21）（q22;q22）[10]/45,X,-Y,t（8;21）（q22;q22）[5]

克隆描述

③无关克隆：

按其大小排列

④混合性核型[cp]：

肿瘤内存在的核型异质性，然而不同的细胞却具有一些相同的细胞遗传学特征，但它不一定见于所有的细胞，而是各种克隆异常的集合。

举例

47，XY,+8

45,XY,-7

46,XY,-7,+8

48,XY,+8,+21

46,XY,-7,+21

47,XY,-7,+8,+21

45-48,XY,-7,+8,+21[CP6]

三、染色体检查方法学

染色体制备：

取材、培养、收获

显带：

Q，G，R，C

染色体分析：

镜下、照相、电脑分析

接种

培养液：

1640（含谷氨酰胺）

计数有核细胞：

接种浓度：

1´106/ml

无菌操作

培养

培养方法：

常用不加PHA短期培养法（24，48h），直接法，同步化法及加秋水仙胺过夜法

B细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）需以多克隆B细胞活化剂（PBA）的刺激。

常用的有美洲商陆（Pokeweedmitogen，PWM），佛波酸酯（Tetradecaoyl-o-phorbol-13-acetate，TPA）及细胞松弛素B，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等

表2不同培养方法的适用范围及缺陷

核型分析

镜下

照相

电脑

第二部分染色体异常与恶性血液病

一、染色体异常与淋巴细胞恶性肿瘤

ALL

ALL包括成人ALL和儿童ALL两大类。

80%的儿童发生在2-5岁之间。

成人在50岁左右呈峰值。

60-85%的ALL具有异常核型，以前B-ALL居多。

在T-ALL中仅占39%。

Williams应用骨髓直接法，

Yunis应用高分辨技术同样检测出如此高比率的异常核型。

（一）染色体数目异常

几乎半数以上的ALL伴有染色体数目的异常，

同时伴有结构异常者更为常见，占到此类病例的40-70%。

数目异常分类

①低超二倍体（47-50）

②高超二倍体（>50条）

③亚二倍体（<46条）

④假二倍体

⑤近三倍体

⑥近四倍体

⑦伴有单一染色体缺失或增加的核型异常。

儿童ALL染色体数量异常分布

成人ALL染色体数目异常分布

1、超二倍体：

核型特征：

通常累及的染色体为X,4，6,10,14,17,18，19，21;97-98%病例有+21，且有多个拷贝。

半数具有超二倍体的成人ALL可同时伴有结构异常。

Dup（1q）,I（17q）常见，t（9;22），t（1;19）。

超二倍体ALL临床特征

儿童（>50条染色体）

年龄：

1-9岁

白细胞计数偏低（中位数6700/ul）

免疫表型pre-pre-B或pre-B，

LDH低，

预后良好，出现t（9;22）预后不良

预后分型

51-55条染色体：

5年EFS72%

55-65条染色体：

5年EFS86%

P=0.04

出现+4，+10可作为一个独立的亚型，预后最佳，通过抗代谢药物可治愈。

成人超二倍体ALL

成人

超二倍体（>50）并未显示更好的预后。

伴有不良预后因素的结构异常如Ph染色体等。

2、亚二倍体

2-8%的病例伴有此类异常。

最常见的染色体缺失为1，5，6，10，11，18，19，21，22等。

这些染色体号数改变如同超二倍体改变所见。

几乎所有的亚二倍体（30-40条）伴有结构异常（半数累及Ph）。

2、亚二倍体

临床上

免疫分型为前B表型，

白细胞计数通常高于二倍体或超二倍体组。

预后不良。

4、单一染色体的增加或丢失

染色体为+8，-20，+21。

但只有10-20%的病例是孤立出现的。

第三届国际白血病染色体研究组（TIWCL）的报告显示+21是最常见的染色体获得，但通常在超二倍体中出现。

+8在ALL中的发生率为1-2%

（二）结构异常

特征性染色体与ALL

1、t（9;22）（q34;q11）

核型特征

t（9;22）（q34;q11）临床特征

年龄偏大，白细胞数及幼稚细胞计数增高，WBC>330´109/L。

某些研究显示常累及肝脾，淋巴结。

前B表型，CD10+表达增多。

髓系抗原在40%-65%的Ph+病例中可有表达。

Ph（+）患者缓解期短低（10v18月），复发率高。

无病生存期（EFS）<5-10%。

主张应大剂量化疗和allo-BMT。

t（9;22）（q34;q11）分子特征

BCR/ABL融合基因

50%的ALL的BCR断裂点发生于M-BCR（b1-b5或e12-e16），P210BCR/ABL

50%成人ALL及80%儿童ALLBCR断裂点落在mBCR区域而产生e1a2BCRLABL融合基因，其产物为P190。

t（9;22）（q34;q11）分子特征

P190和P210蛋白都具有酪氨酸激酶的活性，但P190尤甚。

VanRheeRT-PCR技术，发现80%CML慢性期患者，100%CML急性期，100%P210（+）ALL可检测到P190，

区别在于在ALL中P190/P210比率要高于CML10倍，CML慢性期与急性期比率接近。

ALL与CML急淋变区别

a）缺乏慢性期；

b）诊断时有正常核型存在；

c）CR时Ph消失；

d）50%的病例有和Ph（+）的CML不同的分子学异常。

2、11q23异常

60-70%婴儿急性白血病，分子研究证实（70-81%），10%成人ALL。

曾经应用拓扑酶抑制剂治疗后，发生率可高达80%。

至今已发现40余种与11q23发生易位的断裂位点，最常见t（4;11）,其次t（11;19）

11q23预后

极差：

3年EFS19%v46%（11q23无重排）

1年EFS24%V100%

t（4;11）（q21;q23）（MLL-AF4）

1977年首次由Oshimra描述。

可见于60％婴儿ALL，3-6%成人ALL及2%儿童ALL。

女性多见，高白细胞计数（WBC>100´109/L），肝脾、淋巴结肿大，易累及CNS。

FAB分型为L1或L2，

核型特征

形态学与细胞化学特征

偶有单核样细胞

POXSBB（+）

NE可阳性

TdT（+）

t（4;11）（q21;q23）免疫表型

免疫表型为早期B前体细胞或前B类型，CD19+，CD10-，HLA-DR+,Igh重排。

65%病例协同表达CD15，CD33，CD13髓系抗原。

推测恶性转化起源于多能造血干细胞阶段，能够分化成髓系及淋系。

t（4;11）（q21;q23）预后

不论成人还是儿童，伴有t（4;11）的ALL预后差，

法国血液病细胞遗传学研究组成人ALLt（4;11）,CR75%，中位无病生存期7个月。

同整个11q23组相比，预后更差

强烈化疗或采用ALLO-BMT，近60%的患者可长期生存。

t（11;19）（q23;p13）（MLL-ENL）

与t（4;11）临床特征及预后类似。

11q23异常基因特征

1991年，ZieminvanderPoel及其他学者鉴定了位于11q23上的基因为“混合系列白血病”基因（MLL，ALL-1，HRX，HTRX1）。

该基因编码分子量为431KD蛋白。

与AT的DNA双螺旋结合。

MLL蛋白功能

MLL蛋白的功能不明，可能与DNA的直接作用或与其他DNA结合蛋白的相互作用调节分化通路。

在与11q23发生易位的各类血液病中，MLL基因的截断导致功能的丢失尤其与伙伴基因形成融合基因是其致病的关键因素。

3、19p13异常

包括2个类型

t（1;19）（q23;p13）;

t（17;19）（q11-12;p13）

t（1;19）（q32;p13）（E2A-PBX1）

1984年由Carroll首次描述，在儿童ALL中占总数的5-6%，30%儿童前B-ALL（cIg（+）,SmIg（-））,1%早期前B儿童ALL（cIg-,sIg-）。

成人ALL发生率少于5%。

t（1;19）（q32;p13）易位形式

两种主要形式：

1）不平衡易位：

+der（19）t（1;19）,占t（1;19）的75%，

2）平衡易位：

t（1;19）,较不平衡易位少见。

二者临床上无差异。

t（1;19）（q32;p13）临床特征

WBC：

20-30´109/L，高LDH水平，DNA指数<1.6,非高加索人种多见

常有CNL

CD19+,CD10+,CD22+,CD34-,CD20+/-

预后差，是一个独立的预后因素。

平衡易位尤甚。

强烈化疗：

不平衡易位组有改善

t（1;19）（q32;p13）分子机制

19p13.2-13.3上的E2A基因，可编码2个转录因子E12和E47。

其蛋白产物中含有HLH域能结合至免疫球蛋白K轻链基因增强子KE2元件上，对正常造血及B细胞发生具有重要的调节作用。

染色体重排保留了E2A的激活域，但其DNA结合域及HLH二聚体域被PBX1取代。

E2A-PBX1具有潜在的激活子的功能。

②t（17;19）（q21-22;p13）

E2A-HLF（肝白血病基因Hepaticleukemiafactor）

临床上与t（1;19）相似。

4、t（8;14）（q24;q32）

约占3%ALL，85-90%成熟B-ALL

有3种易位形式

t（8;14）（q24;q32）85%IgH

t（2;8）（p12;q24）5%Igk

t（8;22）（q24;q11）15%Igλ

t（8;14）（q24;q32）临床特征

Burkitt型白血病，男多于女，成人多于儿童。

白细胞计数偏低，WBC10´109/L,1/3病例合并中枢白。

L3型，少部分病例可见于L1，L2。

免疫表型常sIg+，同时可表达CD19+，CD20+，部分还表达CD10+。

核型

t（8;14）（q24;q32）分子机制

（8;14）导致8q24几乎整个C-MYC密码子以头对头形式（5’到5’）易位至14q32。

IgH基因断裂点发生在一个较大的范围内，接近170-190Kb。

在变异形式易位中，8q24C-MYC基本保留在8q24上，而位于染色体2p12和22q11的IgL基因则以头尾方式易位至8号染色体上与c-myc形成融合基因。

t（8;14）（q24;q32）分子机制

c-myc致病的可能机制是由于受Ig基因高度活化的调节因子序列的影响，使其自身发生异常表达。

或者由于自身的突变、缺乏或应用不同的转录因子的启动子，导致基因的异常表达。

t（5;14）（q31;q32）

B-系列ALL伴嗜酸粒细胞增多，由于该易位融合免疫球蛋白重链基因与IL-3基因，因此推测细胞难以控制的增殖与IL-3的作用有关。

克隆分析表明，嗜酸粒细胞成分是反应性增多而非肿瘤克隆。

t（12;21）（p12-13;q22）

TEL-AML1

常规细胞遗传学不能检出,25%儿童前BALL携带t（12;21）,成人：

<4%

年龄1-10岁，1-5岁占72.2%，FAB：

L1或L2，

免疫表型：

CD10+前B，24.6%t（12;21）患者协同表达髓系抗原（CD13，CD33，CDW65）。

预后

未明确：

早期：

预后极佳，4年EFS90%以上

复发病例，20-24%

前瞻性

TEL/AML1分子机制

TEL:

453aa,ETS家族，含DNA结合域和HLH域，序列特异转录抑制因子。

AML1:

480个氨基酸,5个区，调节一系列细胞因子表达。

TEL/AML1:

TELHLH域与AML1DNA结合域、转录激活域融合

融合蛋白同时干扰正常TEL和AML1功能。

T系列

约为15%ALL，L1或L2

断裂点通常累及TCR基因g/d,b,a,分别位于14q11,7q34-36和7p15.

易位包括：

t（11,14）（p13;q11）25%ofT-ALL

t（10;14）（q24;q11）5-10%ofT-ALL

t（1;14）（p32-34;q11）3%ofT-ALL

t（8;14）（q24;q11）2%ofT-ALL

t（11;14）（p15;q11）1%ofT-ALL

t（10;14）（q24;q11）融合基因HOX11-TCRδ。

变异形式t（7;10）（q35;q24）HOX11-TCRβ.

该组患者预后良好，CR100%，中位生存期46个月。

3年无病生存率75%。

其他累及14q11异常的易位

如t（11;14）,t（1;14）,inv（14）（q11;q32）,del（14）（q11）则预后不良.t（14;14）（q11;q32）与小脑共济失调毛细血管扩张症继发T细胞白血病

TAL1基因重排

TAL1基因位于1p33，

其可发生于累及1p33易位及无1q33的易位之中。

在儿童ALL中常见，通常CD3-，但仍属于α/β系列。

TAL1基因重排

与染色体易位相关，（1;14）（p33;q11）及t（1；l7）（p33;q33）,另t（1;3）（p33;p21）也可见。

25%-30%非染色体改变的患者可有TAL1重排。

通常为缺失。

此组患者通常为CD2+，CD10-。

对治疗反应同无重排组相比无显著差异，但DFS显示更长。

预示良好的预后。

非特异系列

12p异常，

占10%病例。

绝大多数为前B表型

总的预后良好，CR92%，中位DFS36个月，3年DFS73%。

成人ALLCR88%，中位DFS39个月，3年DFS36%。

非特异系列

6q-

通常为伴随性改变

通常为中间缺失，6q14,6q21,6q23是常见的缺失区域。

FAB分型L1orL2预后中等。

非特异系列

t/del（9）（p21-22）

7-12%ALL患者有9p-，通过分子技术，异常检出率可提高到29%。

IFNα和IFNβ1基因位于此缺失区域。

发生在9p21的缺失、易位或突变导致p16（MTS1/CDKN2）肿瘤抑制基因的灭活和丢失。

可能为疾病发生的机制。

t/del（9）（p21-22）临床特征

t/del（9）（p21-22）FAB分型为L1orL2，免疫分型为TorB，但大部分为T-ALL，WBC高，肝脾肿大，髓外浸润，预后不佳。

表5急性淋巴细胞白血病细胞遗传学与免疫分型相关性分析

染色体异常与非霍奇金淋巴瘤

t（8;14）与Burkitt淋巴瘤

1972年，Manolov发现该异常

t（8;14）是Burkitt淋巴瘤特异染色体畸变

非Burkitt：

小无裂细胞淋巴瘤

大细胞免疫母细胞淋巴瘤

获得性免疫缺陷综合征（AIDS）相关的Burkitt淋巴瘤（100%）

AIDS相关的DLCL（30%）

B-ALL（L3）

t（14;18）（q32;q21）与滤泡性淋巴瘤（FL）弥漫性大细胞淋巴瘤（DLBCL）

70%~90%的FL及20%的DLBCL

伴3q异常，t（8;14）

BCL2-IGH:

BCL2重排导致表达失调，过量表达的BCL2阻止细胞凋亡

预后不明,伴t（8;14）不良

核型特征

t（11;14）（q13;q22）与套细胞淋巴瘤（MCL）

30%~55%的MCL

50%伴有附加染色体异常，常见的有11q-,13q-,3q异常，+12,6q-,1q-,9q-

3%的多发性骨髓瘤，20%的幼淋细胞白血病

预后差，中位生存期3年

BCL1-IGH:

BCL1重排导致转录失调。

核型特征

3q27异常

t（3;14）（q27;q32）,t（3;22）（q27;q11）,t（2;3）（p12;q27）

40%DLBCL和10%FL可见此异常

BCL6重排导致的表达异常

核型特征

t（2;5）（p23;q35）与间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）

ALCL:

形态学特征与临床特征高度异质性的NHL

表达CD30

t（2;5）（p23;q35）主要出现于CD30+儿童及年轻患者

通常有皮肤及淋巴结浸润

NPM-ALK:

染色体异常与其它淋巴细胞增殖性疾病

染色体异常与CLL

12-三体

CLL最常见的数量异常，常规细胞遗传学技术可检出11%此类异常，应用间期FISH技术，55%的CLL患者可检测到三体12。

孤立出现的12三体是CLL早期主要的细胞遗传学特征，晚期可合并其他染色体改变。

12三体FISH特征

12三体嵌合性

12三体阳性的患者也只有部分间期核出现三体特征

应用免疫表型联合FISH技术，可以确定30-70%的细胞拥有12三体

推测12三体在B-CLL的发病过程中是一个继发事件。

12三体临床特征

拥有不典型淋巴细胞形态，混合10-55%幼淋细胞或大淋巴细胞数量增加。

CD5-，FMC7+，膜免疫球蛋白染色强阳性。

CD11a的表达与12三体CLL密切相关。

预后：

与其他染色体异常（MS8.6年）或正常核型（MS14年）相比，预后差（MS5.4年）

13q异常

占20%克隆性异常的CLL，其中1/3为缺失，其余易位，缺失包括：

del（13）（q12q14）del（13）（q14q22）。

应用分子技术，45-50%CLL有13q-,但多数的病例不影响13q14的Rb基因

13q-较其他异常佳。

11q-

应用分子探针，20%的CLL可检测出此类异常。

其缺失区域为2-3Mb，ATM（ataxia-telangietasia）定位于此。

证据表明该基因可作为一个肿瘤抑制基因。

11q-临床特征

年轻居多，在典型淋巴细胞CLL中常见，伴淋巴结肿大者进展迅速

如年龄<55岁，生存期明显缩短。

中位生存期64个月。

14q+通常为结构异常，占克隆异常的16%

t（11;14）（q13;q32）IgHBCL-1

t（14;18）（q32;q21）IgHBCL-2

t（14;19）（q32;q31）IgHBCL-3

14q+预后

3/414q+的CLL伴有其他染色体的改变。

14q+伴+12预后差。

其他还有17p-,约占10-17%CLL患者，绝大多数为疾病晚期出现，预后差，

6q-也是常见的伴随的异常，缺失区域常位于6q21和6q25-27。

染色体异常与MM

常规细胞遗传学可检测到20-50%

加入IL-3，IL-6提高到60%

FISH技术可发现几乎所有MM患者存在染色体异常

结构异常（14q32）

t（11;14）（q13;q32）

t（4;14）（p16;q32）

t（6;14）（p25;q32）

t（14;16）（q32;q23）

t（8;14）（q24;q32）

t（14;18）（q32;q21）

t（11；14）在临床上与周血及骨髓中浆细胞数量密切相关，恶性度高，进展迅速，MS8.1个月

数量异常

70%患者，其中三体84%，单体16%

三体最常见是+9，+1，+15

单体最常见是–13（33.3%-47%异常核型

预后

第二部分染色体异常与恶性血液病

二、染色体异常与髓系恶性血液病

染色体异常与急性髓系白血病

概述

约55-78%成人AML患者及79-85%的儿童AML伴有染色体异常。

55%的AML病例只以单独异常出现，

结构畸变为主。

高达39种之多，数量畸变相对次要。

t（8;21）（q22;q22）与AML-M2b

由Rowley于1973年首次鉴定。

约12%的AML，18%的AML-M2可检出此异常。

在t（8;21）（q22;q22）异常中，M2占92%，M47%，个别为M1型。

75%的患者可同时伴有额外染色体的异常，其中以缺失性染色体为最多见（73%），-X,41%女性，-Y,61%。

9q-为11%，7q-10%，+8为7.5%，少见+4。

t（8;21）（q22;q22）临床特征

年轻患者居多，中位年龄25-30岁

预后良好：

中位生存