实验室常用的细菌作用及其选择说课讲解.docx

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实验室常用的细菌作用及其选择说课讲解

第一篇：

JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别

1：

DH5a菌株

DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。

E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。

可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

基因型：

F-，φ80dlacZΔM15，Δ（lacZYA-argF）U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17（rk-，mk+），phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1

2：

BL21（DE3）菌株

该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合表达非毒性蛋白。

基因型：

F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）

3：

BL21（DE3）pLysS菌株

该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。

PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。

该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

基因型：

F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr

4：

JM109菌株

该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株

基因型：

recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]

5：

TOP10菌株

该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

基因型：

F-，mcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC），φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ（ara-leu）7697，galU，galK，rps，（Strr）endA1，nupG

6：

HB101菌株

该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验

基因型：

supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1

第二篇：

JM110或SCS110

大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。

常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.

部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI,BclI等。

而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。

而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：

（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；

（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

E.coliJM110

要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110

如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化.

第三篇：

各种感受态细胞的区别用途特征

Xl1-Blue菌株

基因型：

endA1gyrA96（nalR）thi-1recA1relA1lacglnV44F‘[Tn10proAB+lacIqΔ（lacZ）M15]hsdR17（rK-mK+）。

特点：

具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。

用途：

分子克隆和质粒提取。

BL21（DE3）菌株

基因型：

F–ompTgaldcmlonhsdSB（rB-mB-）λ（DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5]）。

特点：

该菌株用于以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。

T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合于非毒性蛋白的表达。

用途：

蛋白质表达。

BL21（DE3）ply菌株

基因型：

F-ompTgaldcmlonhsdSB（rB-mB-）λ（DE3）pLysS（cmR）。

特点：

该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。

此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基

因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。

适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

用途：

蛋白质表达

DH5α菌株

基因型：

F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ（lacZYA-argF）U169,hsdR17（rK-,λ–

特点：

一种常用于质粒克隆的菌株。

其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。

recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。

用途：

分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

JM109菌株

基因型：

endA1glnV44thi-1relA1gyrA96recA1mcrB+Δ（lac-proAe14-[F‘traD36proAB+lacIqlacZΔM15]hsdR17（rK-mK+）。

特点：

部分抗性缺陷，适合重复基因表达,可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。

用途：

分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

第四篇：

E.coliElectro-Cells

E.coliElectro-CellJM109

制品名TaKaRaCode包装量价格（人民币元）

E.coliElectro-CellJM109D90221Set（50μl×10支）300

■Genotype

E.coliJM109

recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,

Δ（lac-proA/F'[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]

■细胞浓度

1～2×1010Bacteria/ml

■保存

-80℃

■制品说明

用高电压脉冲电流瞬间击穿大肠杆菌，从而导致DNA转入大肠杆菌内的转化方法称为电穿孔法。

电穿孔法是各种转化方法中效率最佳的方法之一，比Ca2+处理的感受态细胞的转化效率高，在转化少量DNA时，特别能发挥其特有的威力。

TaKaRa使用独自开发的菌体培养法，制作出了效果极佳的E.coliElectro-CellJM109。

■细胞种类

α-互补性选择宿主E.coliJM109

E.coliJM109在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZα多肽和JM109F'编码的lacZΔM15的结合，显示β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。

利用这一特性，可以很容易鉴别重组体菌株。

因为具有F'质粒，除可用于制作基因库、进行亚克隆等之外，也可作为M13载体DNA的宿主，调制单链DNA。

■质量标准

使用10pg的质粒DNA进行转化时：

50μlE.coliJM109Electro-Cell/10pgpUC19plasmid转化时产生的菌落数

>1×109transformants/1μgpUC19plasmid

F'质粒的稳定性检测

对E.coliJM109使用pUC19DNA进行电穿孔法转化后，在含有100μg/ml的Ampicillin、0.2mM的IPTG,40μg/ml的X-Gal的L-琼脂平板培养基上，产生的白色菌落在1%以下。

50μl的E.coliJM109Electro-Cell在含有100μg/ml的AmpicillinL-琼脂平板培养基上不产生菌落。

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BL21（DE3）pLysS细菌菌株

BL21（DE3）pLysS细菌菌株可以表达T7控制并核糖体结合位点的高效蛋白表达。

BL21（DE3）pLysS对λDE3

（1）是溶源性的。

λDE3含有T7噬菌体基因I，编码的T7RNA聚合酶受lacUV5启动子的控制。

BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，他携带编码T7溶菌酶基因。

在T7启动子控制下，T7溶菌酶降低靶基因的背景表达但并不干扰由IPTG诱导的表达水平。

包装：

P9811500μl

第五篇：

JM109，DH5a，BL21感受态有何区别

1：

DH5a菌株

DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。

E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。

可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

基因型：

F-，φ80dlacZΔM15，Δ（lacZYA-argF）U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17（rk-，mk+），phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1

2：

BL21（DE3）菌株

该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合表达非毒性蛋白。

基因型：

F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）

3：

BL21（DE3）pLysS菌株

该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。

PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。

该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

基因型：

F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr

4：

JM109菌株

该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株

基因型：

recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]

5：

TOP10菌株

该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

基因型：

F-，mcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC），φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ（ara-leu）7697，galU，galK，rps，（Strr）endA1，nupG

6：

HB101菌株

该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验

基因型：

supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1

M110或SCS110

大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。

常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.

部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI,BclI等。

而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。

而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：

（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；

（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

E.coliJM110

要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110

如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化

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实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp,基因间的平均间隔为118bp（基因Ⅷ）。

E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。

利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型（Phenotype），把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。

具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。

分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec等1966年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。

大肠杆菌基因型的表示方法（Demerec,et,al.1966）：

一、一般规则：

1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3个小写斜体字母来表示。

例如：

DNAAdenineMethylase→dam。

2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。

例如：

Recombination→recA、recB、recC。

3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。

如supE44（sup基因座E的44位突变）。

如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。

4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。

这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。

其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。

5、对于携带附加体的菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。

以F因子为例，F-:

F因子缺失；F+:

自主性F因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F':

携带有遗传可识别细菌染色体片段的自主性F因子；Hfr:

整合到染色体上的F因子（highfrequencyofrecombination）。

当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（）“或”/“等以区别。

例如：

/F'[traD36、proAB、lacIq、lacZ.M15]

6、某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“”表示。

例如：

lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为（lac-proAB）。

7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。

例如：

某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：

Streptomycin抗性→Str+或Strr，Ampicillin敏感性→Amp-。

（第一个字母要大写，“+”或“r”表示有抗性，“-”表示无抗性或敏感）。

8、根据某些特异性蛋白的变异及其导致的结果变化进行表示。

例如：

TH2菌株上有一种基因型表示如下：

hsdS20（rB-、mB-），其中S20代表特异性识别蛋白发生变异，（）中的rB-、mB-表示由于S20的变异而导致B株来源的hsdR和hsdM的功能缺失。

9、蛋白质的名称与对应的基因或等位基因相同，但不用斜体，且首字母大写，如，UvrA、UvrB。

三、主要的基因型说明

1、基因重组相关的基因型

recA（Recombination）

功能：

recA基因表达ATP依赖型DNA重组酶，它在λ-噬菌体与基因组DNA的溶原重组时起作用，同时具有对DNA放射性损伤的修复功能。

由recA基因的变异所产生的基因型使同源或异源DNA的重组不能进行，保持插入DNA的稳定性，对DNA的转化有利。

一个菌株的基因型如果是recA,则说明此菌株的表现型是重组缺陷的。

recB（Recombination）

功能：

recB基因表达ATP依赖型DNase和核酸外切酶V的一个亚基，对recA的DNA重组酶起辅助和促进作用。

DNase催化双链DNA的解旋和解链，核酸外切酶V催化单链DNA的裂解，在DNA的重组和损伤修复中发挥重要作用。

recB基因的变异导致其DNA重组和修复功能丧失，保证了外源DNA的稳定，有利于DNA转化。

recC（Recombination）

功能：

recC基因表达四种酶，即核酸外切酶V,ATP依赖型的核酸内切酶，解旋酶及ATP酶，它们和recA,recB所表达的酶相互协调作用，在DNA的重组及放射性损伤的修复中发挥作用。

recC基因的变异导致DNA重组功能缺失，保证外源DNA的稳定性。

2、甲基化相关的基因型

dam（DNAadeninemethylase）

功能：

dam基因表达DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特异序列GATC中A的甲基化，保证DNA免受限制性核酸内切酶MboI的切断，同时在DNA复制时也起一定的辅助作用。

dam基因的变异导致腺嘌呤（A）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤（A）不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。

dcm（DNAcytosinemethylase）

功能：

dcm基因表达DNA胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列，并使第二个C甲基化，即CmCWGG,避免DNA受到相关限制酶的切断。

dcm基因的导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。

mcrA（Modifiedcytosinerestrictionproteina）

功能：

mcrA基因表达大肠杆菌防御体系中起重要作用的mcrA酶，这种酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。

mcrA基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。

mcrB,C（Methylcytosine-specificrestriction）

功能：

mcrB,C基因表达两种特异性蛋白，即mcrB蛋白和mcrC蛋白，它们在大肠杆菌的防御系统中起重要作用。

一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，mcrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA上被甲基化的胞嘧啶（C）的特异序列G5mC上，然后由mcrB蛋白切断（mcrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶），防御外来DNA的侵入。

mcrB,C基因的变异，使上述的对外来DNA的防御作用缺失，对质粒的转化有利。

mrr（Methylationrequiringrestriction）

功能：

mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。

另外，它对限制酶AccⅠ，CviRⅠ，HinfIⅠ（HhaⅡ），NlaⅡ，PstⅠ以及N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明显的抑制作用。

mrr欠损株（基因型）可用于含有N6-mA和C5-mC的DNA的转化。

另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。

hsdM（Hostspecificitivedefective）

Mapposition:

99min

功能：

hsdM基因所表达的DNA甲基化酶是I型限制酶复合体（具有对DNA切断和修补的双重功能）的一部分，它能使DNA双链上的AA（双腺嘌呤）甲基化，保护宿主DNA不被分解。

hsdM的变异使细胞内的DNA不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。

3、点突变相关的基因型

mutS（Mutator）

功能：

mutS基因表达的蛋白具有识别DNA上错配序列的功能，并能修复其错配序列（GC→AT），防止基因突变。

mutS基因的变异导致DNA的错配序列不能得到修复，容易发生基因突变，这对于利用点突变进行基因改造是有利的。

mutT（Mutator）

功能：

野生大肠杆菌在进行DNA复制时，细胞中的8-OXO-dGTP插入模板DNA中的DA位点的效率几乎与插入DC位点的效率相同，导致A-T转换成G-C,使DNA产生变异。

而mutT蛋白就是特异性地降解8-OXO-dGTP成为单磷酸盐（8-OXO-dGMP），这种单磷酸盐状态的G（鸟嘌呤）不能作为底物进行DNA合成，从而防止了上述的基因突变。

mutT基因的变异使细胞中8-OXO-dGTP浓度增高，A→C的突变几率增大，有利于利用点突变进行基因改造。

dut（dUTPase）

功能：

dut基因表达脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase），它能水解dUTP成为dUMP,使细胞体内dUTP的浓度维持在较低的水平，尿嘧啶（U）就不易掺入到DNA中，避免了基因发生A→U的突变。

dut基因发生突变使dUTPase活性缺失，导致dUTP浓度升高，碱基U（尿嘧啶）极易掺入到DNA中，使其发生A→U的基因突变，有利于利用点突变进行基因改造。

ung（UracilDNAglycosylase）

功能：

ung基因表达尿嘧啶-N-糖苷酶，这种酶能特异性识别DNA单链或双链上发生突变的尿嘧啶残基，并从DNA上水解去除尿嘧啶残基，防止DNA发生突变。

ung基因的变异导致上述功能缺失，有利用点突变。

uvrB（Ultraviolet）

功能：

uvrB基因表达核酸外切酶中的b亚基，这种核酸外切酶具有DNA的切补功能，对紫外线损伤的DNA有修补作用。

uvrB基因的变异使细胞中核酸外切酶切除变异碱基的活性缺失，有利于点突变。

4、核酸内切酶相关的基因型

hsdR（Hostspecificitydefective）

功能：

hsdR基因表达I型限制酶EcoK（K12株）或EcoB（B株），在大肠杆菌细胞中起到一种”抗体“的作用，对外来的各种DNA有严格的限制。

HsdR基因的变异导致菌株细胞内的I型限制酶EcoK或EcoB活性缺失，这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。

hsdS（Hostspecificitivedefective）

功能：

hsdS所表达的特异性蛋白是