PCR技术应用.docx

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PCR技术应用

PCR技术应用一：

诊断单基因疾病

自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的诊断。

目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对诊断方法的选择。

JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技术具有快速、准确、操作灵活等特点。

每项进展的实例在以后描述。

在1987年10月前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长时间，而1987年10月以后，应用PCR只需2-4天。

在1987年以前，几乎所有的β－地中海贫血症的产前诊断都是通过检测在β－珠蛋白簇中连锁DNA的多态间接完成的，一般需要2-4周。

1987年10月以后，用PCR扩增β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成β－地中海贫血症的产前诊断。

这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需一周时间。

该项改进技术的作用，

（1）如果我们不能确定在父母双方中β－地中海贫血的突变位置，我们还可以在1、2天之内研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多态性；

（2）通过比较母亲与胎儿DNA序列差别来判断母亲传染的程度。

这只是说明PCR对基因诊断意味着什么的几个例子。

以下我们举几个特例具体说明PCR技术的应用：

（1）通过扩增产物的打点杂交或限制性内切酶酶解方法确定已知的点突变；

（2）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变；（3）通过改变PCR扩增产物的大小或产物不能特异扩增来发现异常缺失；（4）通过对DNA多态性研究来间接诊断致病突变。

最后，还将讨论PCR技术的技术性难点、重要控制条件及局限性。

产前基因诊断基础知识

产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。

1978年Kan和Dozy提出应用与β－蛋白基因连锁的DNA多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。

此种诊断需要进行家族性研究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基因型是用正常β－珠蛋白基因及镰状红胞β－珠蛋白基因探知的。

家族被调查成员包括夫妇俩的孩子，如没有孩子，则调查夫妇双方的父母。

到1982年，通过利用MstⅡ限制性内切酶方法可以直接产前诊断是否有镰状红细胞贫血，因为内切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷蛳xnNⅠ不能在突变位点降解镰状β－珠蛋白基因而可在此位点降解正常βA－珠蛋白基因。

这种改进不需家族调查，就可更准确地进行镰状贫血病的产前诊断。

正是这种改进法，使直接而简便地确定致病突变成为可能，这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。

单基因缺陷的诊断是通过对连锁DNA多态性研究及家族研究而确定的。

到1988年底，我们利用这种方法诊断了一些患Duchenne肌营养不良症病人、大多数甲型和乙型血友病人、所有囊性纤维变性病人及Huntington氏病、神经性纤维瘤和成人多囊肾病人。

应用这种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β－地中海贫血、α地中海贫血有大多数Duchenne肌营不良症、部分甲型血友病和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。

几乎所有这些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技术在产前诊断、症发前诊断及携带者发现等方面具有非常重要的价值。

应用PCR技术直接发现点突变

在点突变诊断中，继PCR技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及直接测序。

JohnHopkins大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血：

（1）将人绒毛膜样品（CVS）或羊水中得到的胚细胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。

（2）应用PCR技术在β珠蛋白基因5'末端扩增一个725bp区，用30个循环，72℃链延伸120''。

（3）用CvnI酶消化725bp扩增产物。

（4）降解的产物进行电泳。

（5）EB染色。

（6）紫外灯下观察DNA片段，并拍照。

在反应中选择使扩增产物含有两固定CvnI位点的引物。

因此，酶解产物至少应可见三条带。

每个镰状红细胞的β珠蛋白基因含有一个381bp带，而正常βA珠蛋白基因经酶结果已积累了大量信息，所以我们倾向选用限制性内切酶法消化经PCR扩增的产物，而不是利用特异寡核苷酸探针经打点杂交来诊断βS突变位置的β突变位置。

然而，这种方法的的局限性（也是Southern杂交的局限性）是不能显示包括第六密码子即βS突变位置的β珠蛋白基因的缺失。

因此，一个杂合子个体（含一个βS珠蛋白基因，及一个基因缺失）与患镰刀状红细胞贫血病人（含两个βs珠蛋白基因）酶切片段的条带图形是一样的。

所以，在诊断这类病人时，会遇到一些困难，最后只有调查其双亲才能确诊。

如果双亲都是βaβs基因型，这个人可确诊为镰状红细胞贫血症。

如果双亲中一个一是βa型，另一个是βaβs基因型，此人诊断为βs杂合子基因型且βs珠蛋白基因含一个缺失。

由于突变引起的疾病具有一定特征，所以，理论上直接确诊β地中海贫血是可能的。

发生地中海贫血症的高危人群为地中海人、中东人、亚州印度人、中国人和黑人。

到1988年底，已知引起地中海贫血的突变有60多种，引起地中海贫血的99％等位基因特征是已知的，其余的等位基因很少或存在于易患者很少的种族中。

因为每种人群有自己的β地中海贫血突变谱，一般情况下，4-6对等位基因在任一特定种族的β地中海贫血基因中占99％以上，因此，使确定易患β地中海贫血的夫妇二人的致病突变简单化。

β地中海贫

血症突变

种族

受影响的限制性

内切酶位点

无意义密码子39

地中海人

增加MaeI位点

IVS-1，nt6

地中海人

增加SfaNI位点（在IVS-2，nt16上也是多态性SfaNI位点

IVS-1，ntl（G-A）

地中海人

丢失BspMI位点

移码6

地中海人

丢失CvnI位点

IVS-2，nt745

地中海人

丢失RsaI位点

－87

地中海人

丢失AvRⅡ点

IVS-2，nt1

地中海人

丢失HphI位点

βe

中国人

丢失MnlI位点

无意义密码子17

中国人

增加MaeI位点

－29

中国人，黑人

增加NlaⅢ位点

无意义密码子43

中国人

丢失HinfI位点

－88

黑人，印度人

增加FokI位点

IVS-1，nt1（G-T）

印度人

丢失BspI位点

IVS-1，nt5（G-A）

阿尔上亚人

增加EcoRV位点

　　通常无子女的配偶双方更应检查，因为他们的红细胞比积及血红蛋白A2含量筛选测试似乎具有β地中海贫血特征。

其方法是检查夫妻双方是否含有所在人群中觉的等位基因型。

自1987年9月以来，在不利用DNA多态性和Southern分析方法情况下，在各种簇中我们在产前明确诊断了80例地中海贫血病人，所有这些诊断是通过直接确定夫妇及其胎儿的突变获得的，此方法通常需要把打点杂交与限制性内切酶分析法结合起来。

需进行基因组序列分析的情况很少。

60种地中海贫血的等位基因突变型的一半以上类型可以通过扩增产物酶切分析方法查明。

对于地中海地区的夫妇，通过这种方法可以分析无意义密码39，移码6，IVS-2，nt-1，IVS-2，nt745，IVS-1，nt-6及-87。

其余在地中海人中常见的突变，IVS-1，nt110，IVS-1，ntl和移码8全由打点杂交发现。

　　在打点杂交分析中，5-19％的扩增产物（通常为β珠蛋白基因从5'起的一半。

片段长度为725bp）在硝酸纤维膜上点两次。

对个体斑点通常是对照，以确定每个斑点代表的是阳性结果，还是阴性结果。

斑点与32p标记寡核苷酸（19mer或20mer）或非同位素标记探针杂交，探针的序列对所研究的突变是特异性的。

另一组同的斑点与正常β珠蛋白基因序列杂交，以确定所定的DNA量足够产生阳性信号。

如果用突变探针杂交结果为阴性而正常探针杂交结果为阳性，那么，我们可断定病人没有携带分析中特写的突变基因。

如果两种探针杂交结果均为阳性，病人为杂合人，病人携带有所研究的突变基因；如果突变探针杂交显示阳性结果，而正常探针杂交为阴性，病人为所分析的突变基因纯合子。

斑点表示ASO探针与用于β地中海贫血产前诊断的β珠蛋白DNA扩增产物的杂交情况。

利用ASO突变探针与扩增DNA杂交，表明双亲携带无意义密码子39的突变。

对照样品，一般用于洗涤特异性监测，它们点在从上数第3，第4点，分别代表正常β珠蛋白纯合子及无意密码39β地中海贫血等位基因纯合子DNA的扩增产物。

上夫妇已有孩子的DNA扩增产物只与突变的ASO杂交，而他们胎儿的扩增DNA既与突变ASO杂交，也与正常ASO杂交，说明胎儿是β地中海贫血携带者。

在夫妻双方的DNA均经过是否含有在其种族中普遍存在的突变等位基因型的检查后，极个别的情况下，夫妇中有一个人的β地中海贫血症等位基因型仍是未知的。

在这点上，需对β珠蛋白基因上重要区段测序以确定未知的致病突变类型。

用T7DNA聚合酶（测序酶）在DNA基因组扩增区上测序。

这些区域DNA包括

（1）启动子，外显子－1，内含子－1，外显子2及内含子－2的5'端90个核苷酸；

（2）内含子2的3'端300个核苷酸和外显子3。

用此方法可以确定几乎所有未知突变类型，但至少有两个例子，在轻度β是中海贫血症等位基因携带者的β珠蛋白基因或5'和3'关键区中未找到突变。

在我们的工作中，通过对PCR扩增的β珠蛋白基因直接测序发现了7种新的等位基因类型。

Huisman在我们没研究的其他种族中也发现了一些新的等位基因。

采用PCR技术发现缺失

利用缺失的5'和3'端引物可以检测出中等大小片段的缺失（1-1.5bp），在印度人群中，患β地中海贫血病人的β珠蛋白基因中通常存在一个619bp缺失片段。

我们发现在DNA中用引物可扩增产生1215bp片段，而当有619bp片段，可认为是缺失杂合子。

缺失也可通过在PCR复合反应中没有缺失基因的产物而其它基因产物仍然存在来测出。

Chehab等自先用此法证明了在α珠蛋白产物表明，纯合缺失片段区至少有一个α珠蛋白引物序列。

最近，Chamberlain把这个方法用于患Duchenne肌营养不良（NMD）的男性的营养不良基因的研究。

DMD是一种X性连锁严重的、早发肌营养不良症，主要原因是由于营养不良基因中缺失大约2000bp片段造成的。

在肌营养不良基因中，大约60-70％DMD等位基因发生大片段缺失。

Chamberlain等已经测出重要区的DNA序列并制备了对这些序列及其它已知序列特异的引物。

他们找出了用9种引物对进行PCR反应，以扩增营养不良基因所在的9个不同区段，在这些区段上有80-90％的缺失已知。

用这些引物对，确定了许多缺失（见第十五章），这些缺失由用营养不良cDNA探针进行的Southern印迹法证实。

这种用PCR复合反应进行缺失分析的方法可用于快速普查，并可在50%的男性病人中发现突变。

其作家族成员还需要进行cDNA探针分析以发现有无其它缺失，以及用DNA多态性分析检测家族内其他患者的情况。

在用复合PCR技术探测缺失方面也有两个局限性。

首先，无论何时当我们研究缺失片段时会担心扩增不出的片段实际上在基因组DNA上存在，只是由于其它未知的原因而没扩增出来。

我们采用此方法，在我们实验室曾遇到过，3个引物在某些正常样品中扩增出3种产物，而在其它的正常样品中3个引物只扩增出2个产物。

因此，在解释9个引物中有8个或7个引物有扩增产物的实验结果时要非常谨慎。

这意味着要进行重复实验才能确证基因缺失的存在。

此外，在临床应用复合PCR技术的早期，可采用相应的营养不良cDNA探针进行Southern印迹法证实缺失片段。

分析易患DMD的家族时，分析携带者是重要的，目前可采用营养不良cDNA探针进行定量Southern印迹法来诊断携带者。

应用PCR技术检测连锁性DNA多态性

在目的基因未被分离出来的情况下，在大多数产前诊断、携带者的发现及症发前诊断中所使用的基因诊断仍可完成。

至1988年底，囊性纤维变性病、Huntington氏病、神经纤维瘤等诊断就属上述情况。

这些病例的基因诊断完全依赖于用与疾病位点连锁的DNA多态性（RFLPs）对患者家族听致病基因进行追踪来完成。

当重要DNA多态性序列周围的DNA序列已知时，应用PCR方法可以很简便地知道重析内切酶位点的存在及丢失。

Mullis和Faloona首先用DNA多态性PCR分析法诊断镰状红细胞贫血，Kogan等用此法诊断甲型血友病，但文献表明应用PCR分析多态性位点周围序列有潜在的局限性，因多态性位点XbaI可以在同一基因组的其它部位复制。

在短扩增片段及扩增Ⅷ：

C因子基因的目的区及第二区的引物上无其它XbaI位点。

对带有Ⅷ：

C因子的男性DNA的XbaI位点分析表明，除了多态性XbaI位点被切割产生的两上小片段外，不被切割的片段由第二区产生。

具有＋／－多态性位点基因型的女性相区别。

当应用Southern印迹法时，就可以区分之，在Southern印迹法中，所分析的片段比从Ⅷ：

C因子基因上复制出的XbaI区大，此XbaI区大小与第二区不同

已报道过应用PCRDNA多态性分析法进行囊性纤维变性的产前诊断及Huntington氏症的症发前诊断及产前诊断。

另外，我们可以利用5个限制性内切酶多态性PCR法，对β珠蛋白基因簇进行单体分类。

如果直接法诊断β地中海贫血和镰状红细胞贫血遇到困难，可采用PCR分析家族成员单体型而间接、快速地进行产前诊断。

因此，PCR被用于许多单基因病变的临床诊断，如镰状红细胞贫血、地中海贫血、甲型血友病、Duchenne肌营养不良症、囊性纤维变性和Huntington氏症。

技术难点

许多难点在开始已提到。

既使其它引物能成功地扩增，一个引物对可能在同样的DNA模板上却无法扩增。

这就给应用复合PCR反应法准确地分析片段缺失带来困难。

由于引物缓冲液被基因组DNA污染，可导致判断上的失误或极大的错误，因在用被污染的引物所做的所有扩增样品中可能会观察到相同的结果。

因此在取样时应十分谨慎，应把PCR所用的玻璃及塑料器皿与一般实验所用的分开，偶尔，不知什么原因造成某个基因组DNA的扩增失败。

常见的是因为在DNA提取过程中造成的污染。

可通过减少基因组解DNA样品也造成扩增失败，这时，需重新提取DNA。

展望

我们预期PCR将能用于普查携带者，尤其是下列一些疾病、在一个或多个种簇中发病率很高的疾病、患者具有典型症状的疾病以及那些有关的基因已知的疾病和导致所有突变等位基因的突变已知的疾病。

应用DNA分析法来普查镰状红细胞贫血β地中海贫血携者是可能的，但非DNA法仍比任何基因检测都兼且简便。

应用PC技术在Ashk-enazi犹太人群中普查Tay-Sachs（家族黑蒙性白痴）等位基因携带者，具有很大可能性。

近来的研究表明在氨基已糖酶Aα链基因的两个等位缺失可能是导致所有Ashken-azi人的Tay-Sachs病基因携带者进行普查。

在北欧人群中，大约50％苯丙酮尿症（PKU）等位基因已被定性。

除了现存基因分析，没有其它方法可以检出PKU携带者。

因有家族病史而非常有可能是携带者检查，当PKU的等位基因完全清楚后，这种检查是可能的。

当找到CF（囊性纤维变性）基因及确定引起CF基因的等位突变特征后就可用PCR技术普查携带者了。

如果等位基因数目小（小于10）且没有简单的生化检测法（以蛋白缺失为原理）可以发现携带者类型时，利用基因技术普查携带者是可行的，利用PCR技术普查人群中CF携带者来确定该病在人群中的发生率也是可行的。

利用PCR技术诊断单基因疾病的可能性极大，利用连锁DNA多态性PCR诊断分析法可对神经纤维瘤、成视网膜细胞瘤、成人多发性多囊肾症及强直性肌营养不良进行诊断。

通过对各种致病基因经PCR扩增后用密度梯凝胶电泳进行外显了序列分析，如甲型血友病基因Ⅷ：

C因子的外显子，可直接对大多数患者进行突变等位基因的直接诊断。

一项新技术使基因诊断发生了重大改革，此技术是将带有寡聚－T尾巴的寡核苷酸固定在滤纸上，使其与生物素化的患者DNA目的区段的PCR产物杂交。

此技术将简化一个个体基因组中5-10个或更多等位基因的分析，象现在的β地中海贫血症等位基因、镰状红细胞贫血症等位基因、PKU等位基因、CF等位基因及Tay-Sachs等位基因等等。

一个复合PCR反应可同时检测一组基因。

在胚胎植入前进行遗传特性分析因有PCR而成为可能。

在分裂期从胚中取1-2个细胞，用PCR可通过这些细胞的DNA进行基因诊断。

此间胚可在体外继续生长，然后植入子宫。

在其它种属中，从分裂期胚中取少数细胞后再植入母体，胎儿的分化同样正常。

因此在胚胎植入前进行基因诊断是可行的。

但此方法的伦理问题是争论的焦点，且让实验检查委员同意将在分裂期被取走少数细胞的人类胚进行植入是不可能的。

PCR技术应用二：

 骨肿瘤诊断

骨肿瘤较罕见，恶性骨肿瘤只占全身恶性肿瘤的1%，男多于女，性别比约为1.6∶1，均好发于10-30岁间，良性者以骨软骨瘤最多，依次为骨巨细胞瘤、内生软骨瘤等，恶性者以骨肉瘤最多，依次为软骨肉瘤、纤维肉瘤等.骨恶性肿瘤的发生机理目前认为是癌基因显性作用与抗癌基因失活的结果，是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果.骨恶性肿瘤转移涉及到肿瘤细胞自身与宿主细胞之间错综复杂的关系，受多种相关基因的调控，即肿瘤的转移与转移基因和转移抑制基因有关，与生长因子及其受体的表达以及某些癌基因产物有关.因此，通过对活化的癌基因及抗癌基因改变的检测，可以快速分析患者肿瘤的易感性及判断肿瘤的预后;检测耐药基因的表达程度，可为肿瘤的诊治提供方案选择的依据;通过对转移基因及转移抑制基因的检测，可以判断肿瘤有无转移，对手术治疗案提供依据.

PCR技术是一门新型快速诊断技术，具有敏感、特异、专一性强等特点，在骨肿瘤诊断及研究方面具有其它方法难以比拟的优越性.

一、PCR技术在骨肿瘤诊断中的应用

骨肿瘤诊断需要解剖学、组织学和胚胎学等基础知识，对病变需认真观察，仔细分析，但更重要的是对临床资料及X线所见要特别重视.骨肿瘤形态变异较大，而临床X线观察较全面，病理镜检有一定局限性，而一些癌基因改变是与某一型骨肿瘤密切相关，即为肿瘤特异性基因，因此在骨肿瘤诊断方面在坚持临床、X线及病理三结合的诊断原则基础上，通过PCR技术对肿瘤特异性癌基因变化的检测，可以更好地辅助骨肿瘤的诊断，具有其它方法不可代替的优越性.

本系统中恶性肿瘤最多见的是骨肉瘤，由于骨肉瘤类型繁多，有多方向分化特点，故形态复杂，除常见的成骨型、成软骨型、成纤维型外，尚有较罕见的恶纤维型、血管扩张型、小圆细胞型，髓内高分化型和富于巨细型的骨肉瘤.骨肉瘤虽多由髓内发生，但也可由骨外膜发生，向外生长形成骨表面骨肉瘤.骨表面骨肉瘤近年来又根据其形态及恶性度的不同分成四个亚型，尽管各型有其形态特征，但在常规诊断时还是有不少被误诊.肿瘤生物学研究表明，骨肉瘤中细胞DNA含量明显高于正常细胞，并具有一系列癌基因的改变，如骨肉瘤中75%的P53基因突变，mdm2、c-myc及c-raf扩增，TPR-met重排等.

首先，我们可以用定量PCR方法检测细胞中DNA含量，来判断肿瘤的良恶性，接着，利用多重PCR或巢式PCR检测P53、mdm2、c-raf、met等的基因改变，来确诊是否为骨肉瘤，同样可以利用数种骨肉瘤特异的单克隆抗体，采用免疫PCR方法对骨肉瘤进行诊断及分型.随着nm生物学技术的发展，可以利用原位PCR方法，先确定好特异性癌基因产物的位置，然后在透射电镱下动态观察其形态及结构，这样可以更好地确诊.

软骨肿瘤的恶性程度除与细胞异形性有关外，和肿瘤发生部位及其体积大小亦密切相关.发生在近心端的如骨盆、肩胛等直径大于6cm者，即使细胞异形性不太明显，也可能为高分化软骨肉瘤，反之若肿瘤发生在远端，虽细胞较密集有中等程度异形性，但一般显示良性生物学行为，可诊断为良性肿瘤.软骨肿瘤分类也十分复杂，根据形态学诊断易误诊，从基因水平来诊断更符合实际情况.首先要区分是良性肿瘤还是恶性肿瘤，运用定量PCR方法，检测细胞中DNA含量，可以判断良恶性.其次，要与骨及其它组织肿瘤相鉴别.研究表明，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、骨形成蛋白、骨钙素、骨连接蛋白等均为骨特异性蛋白，运用定量PCR方法，检测相应基因的表达程度可以确定其组织来源，同样也可以利用相应的单克隆抗体，采用免疫PCR方法确定其组织来源及分型.

近几年的研究表明，癌基因mdm2的扩增与骨恶性肿瘤的转移密切相关，mn23-H1在转移的骨恶性肿瘤中呈低表达，在分化良好的肿瘤中呈高表达因此，运用定量PCR方法检测癌基因mdm2扩增程度，以及mn23-H1的表达程度可以判断骨恶性肿瘤有无转移.

近几年的研究表明，微小转移灶在骨恶性肿瘤发生后不久就存在于周围的血液循环中，骨肿瘤的手术治疗只能解决局部问题，而微小转移灶的清除必须依赖于放疗、化疗或免疫治疗，因此，检测外周血中有无微小残余病灶，可以判断治疗效果，并对是否需要继续治疗提供依据.

二、PCR技术在骨肿瘤研究中的应用

骨恶性肿瘤是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果，到目前为止，发现与骨恶性肿瘤密切相关的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等.发现的癌基因已有100多个，抗癌基因有8个，它们当中究竟还有哪些与骨恶性肿瘤发生发展有关，仍有待于进一步研究.PCR技术是一门快速诊断技术，尤其是PCR相关技术的发展，给分子水平的研究带来了一场革命.使研究的效率大大提高.

①骨恶性肿瘤中癌基因突变、缺失、重排的研究癌基因突变重排常导致肿瘤的发生，因此检测癌基因的改变对研究骨肿瘤发生机理具有重要意义.传统的方法是提取DNA，走电泳，转移到NC膜上，再用标记的探针进行杂交，检测缺失、重排、突变.方法比较繁琐，放射性同位素对人体亦有害，而PCR技术利用一对引物就可以把待检的DNA片段扩增出来，再利用RFLP技术或SSCP技术就可以检测出有无重排、缺失、突变，既方便快速，又对人体没有任何伤害.

②骨恶性肿瘤中癌基因扩增与表达的研究　特异性癌基因的扩增与高表达常导致骨肿瘤的发生，找出这种特异性癌基因对骨恶性肿瘤的发病机理的研究具有重大理论意义，同时，也给临床诊断骨肿瘤带来特异性指标.传统的研究方法首先要提取DNA或RNA进行紫外定量，并用尿素变性电泳鉴定有无降解，然后再转移或打点至NC膜上，用相应的标记好的探针进行杂交，放射自显影，最后进行灰度扫描来定量，这种研究方法最快也得需要二周时间，而定量PCR技术则只需50-80ng的模板DNA或RNA，扩增25个循环，就可以从计算机中打印出结果，得出原始模板当中某个癌基因的拷贝数，可以直接判断出有无某种癌基因的扩增与高表达.运用PCR方法筛选这种特异性癌基因，方法简便，快速，在较短的时间内可以完成相当大的工作量.

③骨恶性肿瘤特异性抗原基因的筛选研究　十多年来对骨恶性肿瘤细胞株的研究表明，骨恶性肿瘤中存在一些特异性抗原与相关性抗原，并且已经研制成了一些特异性单克隆抗体，但是到目前为止，尚未有人筛选出骨恶性肿瘤特异性抗原的基因，传统的研究方法是首先从大量肿瘤组织中提取肿瘤抗原，然后免疫动物，取脾脏等与杂交瘤融合，再从阳性克隆中筛选特异性的单克隆抗体.这种单抗，运用于人体仍然可引起免疫反应，故在九十年代开始，已进行人源性单抗的研制，尤其是丝状噬菌体呈现技术的运用，使得人源性全套抗体库的构建获得成功，避免了免疫动物等一系列繁琐途径.全套抗体库的构建首先利用mRNA.直接反转录成cDNA，构建成cDNA文库，根据抗体可变区基因两侧序列的保守性，设计与之结合的一对引物，以cDNA为模板，PCR扩增出抗体可变区重链和轻链基因，用接头DNA连接起来，再与丝状噬菌体基因Ⅲ5'端重组，表达于噬菌体表面，然后将噬菌体抗体文库通过表面