苦瓜多糖的体外抗氧化性研究毕业设计.docx
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苦瓜多糖的体外抗氧化性研究毕业设计
学号：
136745012
毕业设计
（2013届本科）
题目：
苦瓜多糖的分子修饰方法研究
学院：
科学技术学院
专业：
生物工程
姓名：
指导教师：
完成日期：
2013年06月5日
毕业论文任务书
论文题目
苦瓜多糖的分子修饰方法研究
下发任务日期
2012.5
学生姓名
指导教师
一.论文主要内容
1.苦瓜多糖的提取；
2.苦瓜多糖的分子修饰方法研究。
二.论文的基本要求
查找有关的文献，掌握苦瓜多糖的提取方法，及苦瓜多糖的分子修饰方法，然后独立设计可行性实验，进行实验的准备。
整个实验从设计到实施要独立自主完成，掌握实验室常用仪器设备的操作，锻炼动手能力，培养严谨求实的科研态度，对所得实验数据可以系统分析，得到合理的结论。
三.论文（设计）工作进度安排
阶段
论文（设计）各阶段名称
日期
1
查阅文献，写综述
2012.5.1－2012.6.1
2
试验设计及准备
2012.6.1－2012.7.1
3
试验实施
2012.7.1－2013.4.1
4
数据处理
2013.4.1－2013.5.1
5
撰写论文
2013.5.1－2013.6.1
6
论文答辩
2013.6
备注：
四.应收集的资料及主要参考文献
[1]黄芳，蒙义文．活性多糖的研究进展．天然产物研究与开发．1999．1l（5）：
90-98
[2]王晓娟，魏传晚、徐淑永等．生物活性多糖结构与功效关系研究进展．广州化工．2004．32．
（1）：
6-9
[3]吴东儒．糖类的生物化学[M]．北京：
高等教育出版社．1987
[4]张惟杰．糖复合物生化研究技术[M]．杭州：
浙江大学出版社．1999
[5]来鲁华，杨昱婷．寡糖的构象分析[J]．生物化学与生物物理进展．1995．22（4）：
290-294
[6]周鹏，谢明勇、傅博强．多糖的结构研究[J]．南昌大学学报．2001．25
（2）：
197-203
[7]张惟杰．复合多糖生化研究技术[M]．上海：
上海科学技术出版社．1998
[8]董群、方积年．寡糖及多糖甲基化方法的发展及现状．天然产物研究与开发．1995．7
（2）：
60-64
[9]HakomoriS．Arapidpermethylationofglycolipid,polysaccharidecatalyzedbymethylsulfinylcarbanionindimethylsulfoxide．J．Biochcm．（Tokyo）．1994．5：
205-2ll
目录
中文摘要（关键字）3
英文摘要（关键字）3
前言3
1.1多糖的研究进展3
1.2多糖的提取、分离3
1.2.1多糖的提取3
1.2.2多糖的分离3
1.3.1苦瓜及苦瓜多糖的概述3
1.3.1.1苦瓜皂苷3
1.3.1.2苦瓜蛋白及多肽3
1.3.1.3苦瓜素3
1.3.1.4苦瓜多糖3
1.3.2苦瓜多糖的研究进展3
1.3.2.1苦瓜多糖的提取3
1.3.2.2苦瓜多糖的分子修饰3
1.3.2.3多糖分子修饰的展望与应用3
1.3.2.3.1多糖分子修饰的展望3
1.3.2.3.2多糖分子修饰的应用3
1.4本课题的研究目的及意义3
苦瓜多糖的提取分离与分子修饰3
2.1实验材料与试剂3
2.1.1实验材料3
2.1.2实验试剂3
2.1.3实验仪器3
2.2实验方法3
2.2.1苦瓜多糖的提取3
2.2.2苦瓜多糖脱蛋白3
2.2.3苦瓜多糖的硫酸化修饰3
2.2.4硫酸化多糖体外清除羟自由基能力3
2.2.5苦瓜多糖的乙酰化修饰3
2.3结果与分析3
2.3.1苦瓜多糖的提取结果3
2.3.2苦瓜多糖的脱蛋白结果3
2.3.3硫酸化苦瓜多糖3
2.3.4不同苦瓜多糖对清除羟自由基结果3
2.3.5不同乙酰化度的苦瓜多糖3
结果与讨论3
参考文献3
致谢3
摘要
苦瓜是典型的要是同源植物，已有的药理实验研究表明苦瓜汁及其制剂具有显著的抗氧化作用，苦瓜中抗氧化活性成分是近年来苦瓜药理研究的热点之一。
本实验对苦瓜多糖的提取、纯化及分子修饰进行了如下研究：
1．采用水溶醇提法提取苦瓜粗多糖，酶-Sevage法脱除蛋白，此条件的多糖提取率为9.65%,蛋白脱除率为87.32%。
2．通过对苦瓜多糖进行部分理化性质分析，结果表明：
MCP为白色粉末，能溶于水，尤宜溶于热水，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。
具有典型的多糖反应，且不含淀粉、还原糖、酚类、氨基酸、蛋白质等杂质。
3．硫酸化修饰是多糖修饰中常见的方法之一，其修饰结果是将硫酸基团加到多糖的糖基上，修饰后的多糖称为硫酸多糖。
结果表明硫酸化反应的最初阶段具备较高的反应效率，硫酸化多糖的结构对其活性影响很大。
4．乙酰化修饰也是多糖修饰中常见的方法之一，其主要是修饰多糖分子支链，修饰后的多糖溶液得到较大的改善，一般来讲，修饰后带有乙酰基的多糖，溶解度增加，有利于活性挥发，而且其乙酰化度受到酸与水的比例影响。
关键词：
苦瓜多糖；分离；抗氧化性；分子修饰
Abstract
MomordicacharantiaListhetypicaledibleplants.TheexistingpharmacologyexperimentsshowthatMomordicacharantiajuiceanditspreparationhavesignificanthypoglycemiceffect.AndhypoglycemicactivityisahottopicofpharmacologicalresearchofMomordicacharantiaincecentyears.Inthisstudy,extraction,purificationandhypoglycemiceffectofMomordicacharantiapolysaccharidesareresearchedasfollows:
1．TheMomordicapolysaccharidesisextractedbythecelluoseenzymemethod,andenzyme-Sevagemethodremovalofprotein.Theyieldis9.65%andtheproteinremovalratesis87.32%atthiscondition.
2．Throughtheanalysisofphysicalandchemicalproperties,theresultsshowthatMCPaarewhitepowder,solubleinwater,especiallsolubleinhotwater,insolublein-ethanol,acetone,ethylacetate,butanolandotherorganicsolvents.Ithasthetypicalpolysaccharideresction,andnostarch,reducingsugar,phenols,aminoacids,proteinandotherimpurities.
3．Sulfatedmodificationisoneofcommonmethodsofpolysaccharidemodification,themodificationresultisthesulfategrouptothesugarbaseonpolysaccharide,polysaccharideisreferredtoasthemodifiedversionofsulfatepolysaccharide.Resultsshowthattheinitialphasesulfatingreactionhavehigherreactionefficiency,structureofsulfatedpolysaccharidehadagreatinfluenceonitsactivity.
4．Polysaccharidemoleculesmodifiedmethodaremany,mainlydividedintophysicalmethod,chemicalmethodandbiologicalmethod.Inadditiontothemainchainofthepolysaccharidetothedecoration,canalsobebymodifyingthebranchedchain.Accordingtothechangeofmolecularweightbeforeandaftermodification,canputthepolysaccharidemodificationisdividedintotwokinds,onekindistodirectmodificationofpolysaccharidemolecules,increasethefunctionofthepolysaccharidegroupandthemolecularweight,increaseitsbiologicalactivity;Anotherkindisthedegradationofpolysaccharidemodification,reducethemolecularweightofpolysaccharidesenhanceitssolubilityintheaqueousphase,thusimproveitsactivity.
Keywords:
Momordicapolysaccharide;separate;inoxidizability;molecularmodification.
前言
1.1多糖的研究进展
糖类是自然界中广泛分布的一类有机化合物，在生命活动过程中起着重要作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。
它的主要存在形式有单糖、寡糖、多糖和结合糖。
其中多糖是一类由10个以上单糖分子聚合而成的高分子化合物，广泛存在于动物、植物、微生物（细菌真菌）和藻类地衣中（刘洁等，2011）。
多糖不仅为生物提供骨架结构和能量来源，还参与细胞间的相互识别，机体免疫以及受精和细胞凝聚等过程。
由于多糖类物质的结构复杂，糖类的研究曾经一度被人们遗忘，而随着蛋白质和核酸的研究渐渐揭晓，糖类的重要性逐渐浮出水面。
糖类在生物合成反应、激素激活、细胞增殖、神经细胞的发育、病毒和细菌感染及肿瘤细胞转移等生命过程中发挥着重要的作用（SharonN，1980）；糖链在分子生物学、细胞生物学、膜的化学功能中起着决定性作用（VliegehthartJFG，1984）；多糖作为免疫促进剂，具有抗凝血、抗辐射、抗感染、降血糖、降血脂、促进核酸和蛋白质的生物合成等作用（王云普与王永峰，2003）。
科学家们预言：
“二十一世纪是多糖的世纪”，多糖的研究将成为分子生物学，药物学中不可缺少的部分。
糖类的研究始于100多年前，德国著名科学家E.Fisher开始研究多糖。
1923年，T.Oswld和M.Heidelberger提出细菌的抗原由糖类物质组成而不是蛋白质（彭述辉与曾援，2010）。
20世纪50年代末对真菌多糖抗癌效果的发现，开始了人们对多糖系列的化学研究。
1968年日本研究者千原吴郎首次从香菇中分离β-葡聚糖结构的抗肿瘤多糖，此后人们又发现糖类物质具有多方面的功能和复杂的生物活性，并且研究了多糖的分子量、溶解性、结构、化学修饰等与生物活性的关系。
人们对多糖，特别是其结构与功能活性的认识越来越深刻。
我国对多糖的研究始于二十世纪70年代，地大物博、糖类资源丰富的优厚条件，促使我国对多糖的研究形成迅速的发展趋势。
至今已报道从天然产物中分离出300多种多糖类化合物（冯婷等，2004）。
具有免疫调节、抗辐射、抗病毒、抗肿瘤、延缓衰老、抗感染等多种生理活性的中药多糖，已成为临床上治疗肿瘤、肝炎、心血管疾病的辅助药物。
植物多糖中研究较为深入的是：
茶多糖（孙世利等，2010）、苦瓜多糖（刘国凌等，2010）、枸杞多糖（梁敏等，2010）、芦荟多糖（Sonetal，1998）、当归多糖（王亚平等，1996）、银杏叶多糖（姜波等，2007）等，植物多糖作为抗生素替代物和保健品已取得了良好的应用。
目前多糖的研究多以分离纯化和生物活性方面较多，而其结构测定、构效关系的研究相对滞后。
所以今后一个时期，多糖研究的主要发展趋势是对其构效关系的研究。
从而更全面的解释多糖的化学结构和生物活性之间的关系，研究出大量新的活性多糖，具有十分重要的意义。
1.2多糖的提取、分离
1.2.1多糖的提取
近年来，酶法、微波法和超声波法广泛应用于多糖的提取。
酶法提取的原理在于酶对植物中游离蛋白质具有水解的作用，提取液中只含有少量蛋白质，同时与原料的结合力降低，从而提高多糖的提取率及多糖含量。
竺巧玲（2007）利用纤维素酶提取龙须菜多糖，多糖提取率为34.79%，比传统水提法提高20.38%。
张慧玲等（2007）利用木瓜蛋白酶提取海带多糖，多糖提取率为13.17%，为热水浸提法的1.63倍。
微波技术是通过微波加热作用，借助于微波的电磁场，加速被萃取的植物成分向萃取溶液界面扩散。
吕明等（2011）利用微波技术提取西藏芫根多糖，在微波450W条件下，提取率达到9.13%，与传统法相比不但多糖提取率提高而且反应时间缩短。
张海燕（2011）采用微波辅助提取甘草多糖，多糖的得率是直接加热法的2.2倍，提取时间比直接加热法短从而降低提取成本。
超声波法提取技术是利用超声波产生的强烈震动、高加速度、强烈空化效应及搅拌作用，加速多糖的溶解，缩短提取时间，所以仍具有一定的应用价值。
本次实验我们采取水提醇沉法，其原理是利用多糖不溶于乙醇的原理。
1.2.2多糖的分离
多糖经提取后，长混有较多的蛋白质、色素、低聚糖等小分子杂质。
蛋白质脱除的方法有多种：
①selvage法：
将氯仿按多糖溶液1/5体积加入，然后加入氯仿体积1/5的丁醇，剧烈震摇20min，离心，分去水层与溶液层交界处的变形蛋白质。
此法较温和，但需反复5次左右才能去除大部分蛋白质。
②酶解法：
在样品溶液中加入蛋白质水解酶如胃蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶等，使样品啊中国的蛋白质降解。
通常上述两个方法综合使用出蛋白效果较好，③三氟三氯乙烷法：
将1份三氟三氯乙烷加入到1份多糖溶液中搅拌10min，离心得水层，水层再用上述溶剂处理2次可得无蛋白多糖。
④三氯乙酸法：
在多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸。
直到不再继续浑浊为止，5~10℃放置过夜，离心除去胶状沉淀即可。
某些多糖。
因含有酸、碱性基团，易于蛋白质相互作用，虽不是糖蛋白，但也较难去除。
对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理可以把这种结合蛋白分开。
1.3.1苦瓜及苦瓜多糖的概述
1.3.1.1苦瓜皂苷
苦瓜皂苷是苦瓜中活性成分之一，主要在苦瓜果实中存在，苦瓜种子、茎叶中也含有一定的量、苦瓜皂苷主要包括甾体类皂苷和三萜类皂苷两种。
张令文（2005）等研究报道，苦瓜皂苷纯化物对四氧嘧啶糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用，与高血糖对照组相比，差异显著。
这表明苦瓜皂苷纯化物可以减弱四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善受损伤细胞的功能，具有降血糖作用。
王先远等（2001a）等研究表明，苦瓜皂苷可以通过改变T细胞各亚群比例，促进白细胞介素-2（IL-2）分泌，增加吞噬指数，提高衰老小鼠细胞免疫功能。
另外，苦瓜皂苷还具有良好的抗氧化功能王先远（2001b）实验表明，苦瓜皂苷可使剧烈运动的大鼠血清、骨骼肌和肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）维持较高活力，及时清除体内产生的过氧化物。
苦瓜皂苷具有降血糖、提高免疫力、抗氧化作用外，还具有调节体内分泌、降胆固醇和抗肿瘤等作用（孟延发等，2000）。
1.3.1.2苦瓜蛋白及多肽
苦瓜蛋白及多肽是研究最深入的活性成分之一，主要存在于苦瓜种子中。
苦瓜蛋白主要包括核糖体失活蛋白和类胰岛素多肽等。
Lee-Huang等从苦瓜种子中分离纯化了苦瓜蛋白MAP30，证实起可以抑制HIV-1核心蛋白p24表达及抑制HIV-1反转录酶活性，具有抗病毒的功效。
Porro等（1993）将核糖体失活蛋白与CD50单克隆抗体偶联，发现其体外可抑制周血单核细胞及人体T细胞蛋白和DNA的合成。
体内可抑制JU2RKAT白血病na/nu小鼠肿瘤的发展，可用于治疗CD5+的白血病及淋巴癌。
动脉粥样硬化是一种慢性炎症。
王佐等（2005）从苦瓜果肉中提取的一种分子量为28kD的蛋白质，证明其25mg/kg/d剂量能显著抑制半胱天冬酶的活性及凋亡的发生。
并在细胞和动物水平上对起抗炎和氧化作用进行了研究，证实有其功效。
1.3.1.3苦瓜素
目前研究较多的苦瓜素主要为α-苦瓜素和β苦瓜素。
体外研究表明，α-苦瓜素和β-苦瓜素非细胞毒作用剂量可显著抑制小鼠脾细胞由于伴刀豆球蛋白A、植物凝聚素和脂多糖存在而产生促有丝分裂反应（张伟敏，2005）。
王庆华等（1995）研究报道，α-苦瓜素和β-苦瓜素都能引起怀孕小鼠早期和中期流产。
在早期器官发育阶段可引起体外培养鼠胚畸形生长，头、躯干、四肢出现不正常形态，都具有致畸胎作用。
齐文波等（1999）研究报道实验证明，α、β-苦瓜素对小鼠S-180实体瘤具有显著的抑制作用，抑瘤率分别为71.2%和68.6%。
苦瓜素具有免疫、抗生育、抗肿瘤作用外，还具有抗柯萨奇B3病毒功效。
1.3.1.4苦瓜多糖
苦瓜多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖，主要存在于苦瓜果实中。
苦瓜多糖具有降血糖、抗氧化、提高免疫力、抗肿瘤等功能。
1.3.2苦瓜多糖的研究进展
1.3.2.1苦瓜多糖的提取
从苦果中提取苦瓜多糖传统方法多为水提醇沉法。
随着酶工程的发展及一些其他辅助提取手段的开发应用，苦瓜多糖的提取已经不再是单一的水提醇沉。
本实验采取传统的水提醇沉法进行提取。
1.3.2.2苦瓜多糖的分子修饰
多糖经分子修饰后获得各种结构类型和各种生物活性的多糖衍生物，为多糖构效关系分析奠定了基础。
分子修饰是多糖构效关系研究的重要途径，而构效关系研究结果又指导着多糖分子修饰的方向，为多糖类药物的设计、研究和开发提供理论支持。
多糖在自然界中蕴藏丰富，种类繁多，且结构具有复杂性和多样性，对其进行分子修饰可为药物筛选提供各种结构类型的候选化合物。
分子修饰在多糖研究中将发挥更大的作用。
对多糖分子修饰的研究将出现更多新的改性方法和思路，例如糖肤、糖脂等复合物的研究，将为活性筛选及构效关系分析提供更多的多糖衍生物。
可以预见，随着多糖分子修饰方法的完善和技术水平的提高，将为多糖构效关系研究带来更多方便，运用分子修饰手段将开发出更多高效低毒的新型多糖类药物。
多糖分子修饰的方法有很多，主要分为物理方法、化学方法和生物方法．除了对多糖主链进行修饰外，也可以对其支链进行修饰．根据修饰前后分子量的变化，可以把多糖修饰分成两大类，一类是对多糖分子进行直接修饰，增加多糖的功能基团和分子量，提高其生物活性；另一类是对多糖进行降解修饰，降低多糖的分子量，提高其在水相中的溶解度，从而提高其活性。
1.3.2.3多糖分子修饰的展望与应用
1.3.2.3.1多糖分子修饰的展望
多糖衍生物的抗肿瘤性已经在临床应用上得到了充分的证明，而且多糖衍生物还有许多其他方面的应用，入对纤维素进行化学修饰后可获得离子交换纤维素、抗凝血纤维素等许多有特殊功能的纤维素衍生物，多糖衍生物的抗凝血、抗氧化、抗肿瘤等活性的研究报道也很多。
可以说对多糖的分子修饰方法及其分子修饰后获得的多糖衍生物的生物活性的研究意义重大。
1.3.2.3.2多糖分子修饰的应用
多糖经分子修饰后获得各种结构类型和各种生物活性的多糖衍生物，为多糖结构与功能关系分析奠定了基础，而结构与功能关系研究结果又指导着多糖分子修饰的方向，为多糖类药物的设计、研究和开发提供理论支持。
天然多糖衍生物一般没有细胞毒性且药物质量通过化学手段容易控制，已成为当今新药的发展方向之一，它们在临床应用中显示出广阔的前景，将越来越多地被用作抗肿瘤、治疗艾滋病等抗病毒药、抗衰老药和降血糖药。
可以预见，随着多糖分子修饰方法的完善和技术水平的提高，以及基础医学，临床医学不断深入，运用分子修饰手段将开发出更多抗肿瘤、抗凝血、提高免疫力、抗艾滋病毒等新型药物及保健品。
1.4本课题的研究目的及意义
我国苦瓜资源丰富，品种类型多样，已有近百年的历史。
加强苦瓜多糖资源的开发和综合利用，具有较大的经济效益和良好的社会效益，也有利于推动“糖生物学”的深入研究。
国内外研究表明，苦瓜是一种很好的天然药物，与其药效直接有关的主要有效成分是苦瓜多糖。
而苦瓜多糖组成成分多样，结构复杂。
因此，弄清楚苦瓜多糖的组成成分、分子结构及其药效之间的相关性，从而开发出针对强的高效低毒、安全实用的药物、保健品，具有重大的社会经济效益和广阔的市场应用前景。
本文对苦瓜多糖的分离纯化、分子修饰方法进行了较为系统的研究，主要包括以下内容：
第一，运用传统水提醇沉法提取苦瓜粗多糖利用selvage法除去粗多糖中的蛋白质。
第二，采用硫酸化修饰对苦瓜多糖进行分子修饰，其修饰结果是将硫酸基团加到多糖的糖基上，修饰后的多糖称为硫酸多糖。
第三，采用乙酰化修饰对苦瓜多糖进行分子修饰，其修饰结果是乙酰基能使多糖的支链得到延伸而发生变化，导致多糖羟基暴露在外，从而增加在水中的溶解度，有利于活性挥发。
苦瓜多糖的提取分离与分子修饰
苦瓜（MomordicacharantiaL.），为葫芦科苦瓜属蔓性草本植物，又名凉瓜，锦荔枝、癞葡萄，因其具有苦味得名。
苦瓜不仅是良好的食用价值，而且具有显著的药用价值，属药食同源食物。
近年来研究表明，苦瓜具有降血糖、降血脂、提高免疫力、抗肿瘤等生物功能，而苦瓜多糖为其生物功能重要活性的成分之一。
提取分离是研究多糖的重要前提和基本要求。
多糖的提取常采用水提醇沉法进行提取，所得粗多糖采用Sevage法分离蛋白质得到多糖。
多糖衍生物的抗肿瘤活性已经在临床应用上得到了充分的证明，而且多糖衍生物还有许多其他发面的应用，如对纤维素进行化学修饰后可获得离子交换纤维素、抗凝血纤维素等许多有特殊功能的纤维素衍生物，多糖衍生物的抗凝血、抗氧化、抗肿瘤等活性的研究报道也很多。
可以说对多糖的分子修饰方法及其分子修饰后获得的多糖衍生物的生物活性的研究意义重大。
可以预见，随着多糖分子修饰方法的完善和技术水平的提高，以及基础医学，临床医学不断深入，运用分子修饰手段将开发出更多抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、提高免疫力等新型药物及保健品。
用筛选到的苦瓜多糖为研究对象进行硫酸化修饰，使硫酸化后的糖链具有了负
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