生化分离技术核心知识点.docx

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生化分离技术核心知识点

第一章

生物技术下游加工过程特点：

1.发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液

2.培养液是多组分的混合物

3.生物产品的稳定性差

4.对最终产品的质量要求很高

生物技术下游加工的一般步骤：

1.发酵液的预处理与固-液分离

2.初步纯化

3.高度纯化

4.成品加工

生物技术产品的类型：

1.按分子质量：

小分子质量、大分子质量

2.按产品所处位置：

细胞内、细胞外

第二章

共价过程中导致的失活：

1.集团本身的共价修饰，导致基团功能不起作用

2.蛋白质上任何基因的共价修饰，使三维结构受到破坏

对策：

1.避免细菌污染

2.水分的除去

3.高浓度的化学物质会使蛋白质变性，应避免

4.高浓度的底物、多元醇和稳定盐利于稳定蛋白质

5.对许多蛋白质而言，为防止硫羟基的氧化和降低光氧化的危险，除去空气至关重要

第三章

悬浮液预处理方法：

1.加热法

2.调节悬浮液pH值

3.絮凝和凝聚

4.使用惰性助滤剂

去除悬浮颗粒，依据物理、化学性质：

颗粒密度、颗粒大小、颗粒表面性质

过滤方法：

恒压过滤、恒速过滤、变速变压过滤

过滤器类型：

1.真空过滤器：

转鼓真空过滤器、圆盘真空过滤器、水平带式真空过滤器

2.压滤器：

板框压滤器、加压叶滤器、带式压滤器、气压罐式连续压滤器

带式压滤器的工作必要条件：

料液过滤前都要加絮凝剂进行预处理，使悬浮液成絮团

错流过滤：

如果料液给过滤介质表面一个平行的大流量的冲刷，则过滤介质表面积累的滤饼会减少到可以忽略的程度，则通过过滤介质的流速则减少。

第四章

细胞壁经酸水解，可以获得：

肽聚糖、氨基酸、磷壁酸、糖、脂质

破碎率的评价：

1.直接计数法

2.间接计数法

细胞的破碎按是否外加作用分为：

机械法（高压匀浆法、珠磨、超声波法）、非机械法

超声波法理论依据：

超声波破碎细胞的机理可能与超声波引起的空穴现象有关

非机械法：

1.酶法融胞

2.化学法：

a.酸碱调节溶液pH值

b．有机溶剂常用甲苯

c.表面活性剂是两性化合物

3.物理法：

a.渗透压冲击法

b.冻融法

c.干燥法

4.其他方法：

a.多种破碎方法相结合

b.与下游过程相结合

c.与上游过程相结合

第五章

离心分离可分为：

1.离线沉降

2.离心过滤

3.离心分离+超离心

离心分离因数Fr：

粒子在离心机中产生的离心加速度与自有下降的加速度之比

离心设备的放大：

1.等价时间Gt法

2.Σ因子法

超离心技术分类：

1.制备性超离心：

粒子差速离心、一般密度梯度离心法、等密度离心法

2.分析性超离心：

相对分子质量测定、大分子纯度估计、检测大分子中构的变化

3.超离心设备：

分析用超离心机、制备用超离心机

第六章

膜分离分类：

1.以静压力差为推动力的膜分离过程：

微滤、超滤、纳滤、反渗透

2.以蒸汽分压为推动力的膜分离过程：

膜蒸馏、渗透蒸发

3.以浓度差为推动力的膜分离过程：

渗析

4.以电位差为推动力的膜分离过程：

电渗析

膜的类型：

1.有、无孔膜

2.膜对称性（各向同性膜、不对称膜、各向异性膜）

3.膜的孔道特性

4.膜材料

水通量：

膜对纯水的通过量，是用在压力为0.1MPa,温度为20℃的条件下，透过一定量纯水所需的时间来测定。

截留分子质量MWCO：

相当于一定截留率（90%/95%）的相对分子质量。

膜组件：

平板式、管式、螺旋卷式、中空纤维式

浓差极化：

在超滤过程中，由于水透过膜，因而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓差梯度作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，对水的透过起阻碍作用。

膜的污染：

1.膜的劣化：

化学性劣化、物理性劣化、生物性劣化

2.水生物污垢：

吸着层、堵塞

3.预防和控制膜污染：

①预处理法

②开发新型抗污染的膜

③加大供给液的流速

4.污染膜的清洁：

化学洗涤、物理洗涤

中空纤维膜组件的工作模式：

超滤、再循环、逆洗

超-微滤膜组件的工作模式：

浓缩、透析、纯化

超-微滤系统的工厂布置：

开路式操作、间歇式操作、进料和排放式操作、多次再循环操作

第七章

纳米过滤：

介于反渗透和超滤之间，能截留有机小分子而使大部分无机盐通过，操作压力低

纳米过滤膜的截留相对分子质量一般小于1000，大于300

按纳滤膜的荷电情况可分为荷负电膜、荷正电膜、双极膜

第八章

膜亲和过滤法包括：

亲和膜分离技术、亲和-错流膜过滤

配基及其选择：

通用性配基、特异性配基、间隔臂及其配基

亲和载体有两个特性，拥有其一即可，或能溶于水溶液，或易于悬浮在水溶液

亲和载体的内核：

水溶性大分子量聚合物、非水溶性的粒子

第九章

渗透蒸发：

通过渗透蒸发膜，在膜两侧组分的蒸汽分压差作用下，使液体混合物部分蒸发，从而达到分离目的的一种膜分离法

渗透蒸发膜的分类：

1.根据膜材料的化学性质和组成分类：

亲水膜、亲油膜

2.根据结构不同分类：

复合膜、离子交换膜

膜材料的选择：

溶解度参数法

蒸汽渗透：

当进料是某种混合蒸气，进行渗透蒸发时即为蒸气渗透

第十章

萃取溶剂的选择：

1.利用溶解度参数理论指导溶剂选择

2.根据“相似物容易溶解在相似物中”的规律选择

乳化：

一种液体以细小液滴的形式分散在另一不相溶的液体中

乳状液可分为：

水包油、油包水

乳状液的消除：

过滤、离心分离、化学法、物理法、顶转法

萃取操作：

混合→分离→溶剂回收

萃取因子：

萃取平衡后，溶质在萃取相与萃余相中质量的比值

多级逆流萃取：

若干萃取级，料液与溶剂分别从两端加入，萃取相与萃余相逆流流动，操作系连续进行

微分萃取：

当轻相和重相连续不断地逆流通过萃取器时，就会产生微分萃取，在两相的接触中，溶质从一相转移至另一相中，但一般不可能达到平衡

萃取段：

从含溶质的重溶剂中优先萃取或分离第一种溶质

洗涤段：

从不含溶质的重溶剂则洗涤除去萃取物中不希望有的第二章溶质

第十一章

反胶束：

表面活化剂分散于连续有机相中，一种自发形成的纳米尺度的聚集体

形成条件：

表面活化剂、临界胶束浓度

特性：

极性头向内，活性尾向外

临界胶束浓度：

胶束形成时所需表面活化剂的最低浓度

反胶束中水分为结合水、自由水

反胶束萃取体系：

单一反胶束体系、混合反胶束体系、亲和反胶束体系

蛋白质增溶于反胶束溶液的方法：

注入法、液-固萃取法、液-液萃取法

影响反胶束萃取蛋白质的因素：

水相pH值、离子强度对萃取率的影响、表面活性剂类型的影响、表面活性剂浓度的影响、离子种类对萃取的影响、反萃取及蛋白质的变性

浊点萃取：

以表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，通过改变实验条件而引起相分离，从而将水溶性物质与亲油性物质分离

浊点现象：

在一定温度范围内，表面活性剂易溶于水成为澄清溶液，而当温度升高或降低一定程度时，溶解度反而减小，会在水溶液中出现混浊、析出、分层现象

第十二章

聚合物不相溶性：

由于不同类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相

双水相系统：

1.聚合物/聚合物/水系统

2.聚合物/低分子量成分/水系统

第十三章

利用超临界流体，即温度和压力略超过或靠近临界温度和临界压力、介于气体和液体之间的流体，作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离、纯化目的

液体在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起流体的密度大幅度地变化，而非挥发性溶质在超临界流体中的溶解度大致上和流体的密度成正比。

超临界流体萃取正是利用了这个特性，形成了新的分离工艺。

超临界流体性质：

1.溶解度

2.传递性质

3.选择性

4.选定

5.夹带剂的使用

提高选择性原则：

1.操作温度应和超临界流体的临界温度相接近

2.超临界流体的化学性质应和待分离溶质的化学性质相接近

作为萃取剂的临界流体应具：

1.化学稳定性

2.温度不可太高或太低

3.温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度

4.临界压力不可太高

5.选择性要好

6.溶解度要高

7.要易获取，价格便宜

CO2是天然产物和生物活性物质提取和精制的理想和最常用溶剂

夹带剂：

在纯流体中加入少量与被萃取物亲和力强的组分，以提高其对被萃取组分的选择性和溶解度，添加的这类物质称为夹带剂

SC-CO2萃取工艺流程：

等温变压工艺、等压变温工艺、恒温恒压工艺

第十四章

液膜由膜溶剂、表面活性剂、流体载体组成

液膜分离技术按其构型和操作方式不同分为，乳状液膜、支撑液膜

无流动载体液膜分离机理：

选择性渗透、化学反应、萃取、吸附

有流动载体液膜分离机理：

主要决定于载体的性质，有离子型、非离子型，其渗透机理分为逆向迁移、同向迁移

流动载体应具条件：

溶解性、配位性、载体应不与膜相表面活性剂反应

液膜分离操作过程：

制备液膜→液膜萃取→澄清分离→破乳

影响液膜分离效果因素：

液膜体系组成、液膜分离工艺条件

液膜分离过程的关键：

1.液膜溶胀：

外水相透过膜进入液体内相，从而使液膜体系增大

2.液膜的破损：

搅拌速度影响，接触时间影响，料液浓度、酸度影响，乳水比影响，膜内比影响，操作温度影响

乳水比：

液膜乳化体积和料液体积之比

膜内比：

膜相体积和内相体积之比

第十六章

蛋白质表面大部分亲水，其内部大部分疏水

表面分为荷电区、亲水区、疏水区

小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶剂

蛋白质沉淀加入沉淀剂不同：

加入中性盐盐析、将pH值调节至等电点、加入可溶性有机溶剂、加入非离子型亲水性聚合物、加入聚电解质絮凝、加入多价金属离子

蛋白质沉淀法：

1.中性盐盐析法：

①Ks分级盐析法：

在一定pH值及温度下，改变盐的浓度，达到沉淀目的

②β分级盐析法：

在一定离子强度下，改变溶液pH值及温度，达到沉淀目的

2.等电点沉淀法：

基于不同蛋白质离子具不同等电点这一特性，用依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，获目标产物

3.有机溶剂沉淀法（乙醇是工业最常用的）：

破坏蛋白质的某些键和氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露在表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀，当蛋白质空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全变形

4.非离子型聚合物沉淀法

5.聚电解质沉淀法

6.金属离子沉淀法

亲和沉淀：

将生物亲和作用和沉淀分离技术结合起来的一种蛋白质纯化方法，其实质是配基-产品复合物的沉淀，即利用蛋白质与特定生物或合成的分子间高度专一的相互作用而设计出的一种特殊选择性分离技术，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据吸附有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小，亲和过程提高了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的方法

第十七章

吸附类型：

物理吸附、化学吸附、交换吸附

穿透：

操作开始时，大部分溶质被吸附，故流出液中溶质的浓度较低，随吸附过程继续，流出液中溶质的浓度逐渐升高，开始较慢，后来加速，在某一时刻浓度突然急剧增大

膨胀床吸附步骤：

床层的稳定膨胀和介质的平衡→进料吸附→洗涤→洗脱→再生、清洗

离子交换剂类型：

含合成树脂骨架的多孔弹性颗粒、多糖类骨架的粒子交换树脂（强离子交换材料）（弱离子交换材料）

离子交换剂预处理：

1.用强酸或强碱液洗涤

2.按在离子交换操作时对pH的要求

3.在实验初始阶段，用水或稀盐液洗涤

离子交换剂的选择性：

1.离子交换剂及其上面的离子的强弱和展开剂中离子的强弱

2.离子交换剂对各反离子的亲核性

3.离子浓度

其他吸附；1.疏水作用吸附：

利用溶质和吸附剂表面间弱的疏水性相互作用而被吸附的过程

2.盐析吸附：

由疏水吸附和盐析沉淀组合而成，将硫酸铵沉淀的蛋白质悬浮液，加到一用硫酸铵预平衡的吸附柱中，再用递减的盐浓度展开，达分离目的

3.亲和吸附：

借助于溶质和吸附剂之间特定的生物结合力实现的

4.染料配位吸附：

当亲和吸附中的配基是活性染料时，由于其中有一些染料能对蛋白质有识别作用产生专一性，可逆结合

免疫吸附：

利用抗原-抗体的亲和反应进行分离纯化

固定金属亲和吸附：

包含了金属离子经螯合被固定在吸附剂基质上并与蛋白质上氨基酸中电子供体形成金属配合物

羟基磷石灰晶体有两个不同的吸附面，即存在两种不同的吸附点，起阴离子交换剂作用的为C点，带正电荷；起阳离子交换剂作用的为P点，带负电荷

第十八章

所有层析系统分为：

固定组、移动组、需离析的样品

色层分离过程：

加试样→展开→分部收集

色谱展开是关键，方法：

洗脱分析法、前流分析法、顶替分析法

阻滞因素：

溶质的迁移速率和一个理想标准物质的迁移速率之比

溶出体积：

溶质的最大浓度区从柱中流出时已流出的流动相体积

容量因子：

衡量色谱柱对分离组分保留能力的重要参数，意味着在固定相和移动相中溶质数量的比例大小

吸附色层分离法利用吸附剂对组分的吸附能力的差别进行分离，用了填充柱的物质包括无机吸附剂、有机吸附剂

疏水作用色层分离法原理：

靠疏水基团的疏水力分离生物大分子在的液相色谱法。

利用生物大分子如蛋白质表面暴露的疏水部位和疏水介质上的疏水配基的疏水作用来表达分离目的

共价作用色层分离法：

利用溶质分子与层析剂凝胶间的共价吸附作用将目标产物与其他溶质分子分离开

聚焦色层分离法原理：

利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质分离纯化

离子交换色层分离法原理：

通过带点的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达分离目的

凝聚过滤色层分离法是以多孔性凝胶作为介质利用分子筛原理将生物物质按其分子大小不同而建立起来的一种分离纯化方法

原理：

含不同组分的溶液，过网状的凝胶粒子，小分子物质自由扩散于凝胶颗粒隙缝中进入凝胶相，大分子被排阻在外，加入洗脱剂后溶液向下推移，重复上述扩散、排阻。

最先洗出的洗脱液中含大量大分子，最后出的含大量小分子，分段收集可获各种相对分子质量大小的区段

凝胶过滤介质：

葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶

第十九章

Zeta电位是动点现象的根本原因。

是在静止流体和流动流体间剪切面上的动电电位

动电现象：

固-液或液-液界面在外加电场作用下做相对运动而产生的电场现象

质点的电泳迁移率，在电位梯度作用下，单位时间内质点所移动距离

影响质点电泳迁移率的因素：

颗粒性质、电场强度、溶液性质（pH值、离子强度、黏度）、其他（焦耳效应、电渗、吸附、分子筛分离、扩散、缓冲液性质）

电泳类型：

自由界面电泳、自由相中的区带电泳、不同支持物上的区带电泳、有机溶剂中的凝胶电泳、亲和电泳、等速电泳、等电聚焦、免疫电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：

以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳是目前分离生物大分子的最好方法。

其分离是以它们的物理差别、分子大小和净电荷为基础，即分离除了利用物质所带电位的差别外，还具分子筛的特殊作用，这种性质为分开电泳率很相近的大分子提供了简单有效的方法。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

加有阴离子去污剂-SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于分离蛋白质和测定他的相对分子质量。

原理：

SDS以一定比例和蛋白质结合并使它带大量负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质间的电荷差别下降乃消除，同时蛋白质结构变松散，形状变一致，排除电泳中电荷影响。

等电聚焦原理：

利用电场和pH梯度的复合作用来实现两性物质分离二维电泳最高分辨率，第一维度使用等点聚焦，第二维度使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

免疫电泳：

将琼脂电泳与琼脂扩散结合起来的一种免疫化学技术，使具有相同电泳迁移率的物质通过抗原与同源抗体间的特异沉淀反应来检测所形成的沉淀数目，相当于不同抗原存在的数目

毛细管电泳：

以内径为20~200μm的柔性毛细管柱作为分离通道，以高压直流电场为驱动力，对各小分子、大分子及细胞等进行高效分离、检测或微量制备的总径

第二十章

重组蛋白更易或包含体形成原因：

表达量过高、重组蛋白的氨基酸组成、重组蛋白所处环境、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白、在细菌表达蛋白质过程中，蛋白质间的离子键，疏水键，共价键等化学作用导致了包含体形成

包含体：

基因工程菌表达的外源蛋白质由于来不及加工而堆积在一起形成致密的颗粒

从包含体中回收有生物活性的蛋白质：

从大肠杆菌中提取包含体并洗涤→对洗涤后的包含体进行溶解（尿素、盐酸胍）→对变性蛋白进行体外重折叠恢复活性→对复性蛋白进行纯化获高纯度蛋白

包含体复性方法：

透析法、稀释法、超滤法、色谱法、其他复性法

第二十一章

结晶：

过饱和液形成→晶核形成→晶体生长

初级成核无任何晶体或有这样的晶体存在，影响小或无

二次成核有晶体存在，很大影响

二次成核：

物质的一个或几个晶体存在他们的过饱和溶液中，会引起新晶体生长，其中成核作用，不会按其他方式发生

结晶方法：

一次结晶、重结晶、分级结晶

重结晶：

结晶的一种重复过程

杂质夹带原因：

1.某些杂质与产物溶解度相近，产生共结晶

2.有些杂质会被结合到产物结晶晶格中

3.因洗涤失效不除去结晶中所有母液，使晶体沾染杂质

重结晶方法：

简单重结晶、分级重结晶

第二十二章

微生物生产过程，原始湿物料呈毛细-多孔状胶体，性质取决于含水率，物料中毛细管壁有弹性，并与水相互作用会膨胀

按水分原始聚集态，干燥可分为从液态开始干燥和绕过液相从固态直接蒸发-升华

喷雾干燥时，被干燥的溶液或悬浮体用特殊装置来雾化，在干燥室中或细小分散状与气体干燥介质结合

升华干燥原理：

湿物料从冻结态下除去水分，即水分不经液态直接升华或气态而脱水的干燥过程