可见光分光光度法.docx
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可见光分光光度法
第10章可见光分光光度法
（VisibleSpectrophotometry）
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称吸光光度法，它包括比色法
（colorimetricmethod）和分光光度法（spectorphotometry）。
比色法是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质含量的；分光光度法是通过物质对光的选择性吸收来测定组分含量的，它包括紫外分光光度法（ultravioletspectrophotometry）、可见光分光光度法（visiblespectrophotometry）、红外分光光度法（infraredspectrophotometry）等。
可见光分光光度法具有灵敏度高、准确性好、仪器设备简单、操作简便快捷等特点，许多无机物都可直接或间接地用此法进行测定。
此法不仅用于组分定性、定量分析，还可用于对化学平衡及配合物组成的研究等。
10.1可见光分光光度法基本原理
10.1.1物质对光的选择性吸收与物质颜色的关系
光是一种电磁波。
电磁波谱的波长（或频率）范围很广，其中人眼能感觉到的可见光的波长范围是400~750nm。
单色光（chromaticlight）是仅具有单一波长的光，复合光是由不同波长的光所组成的，人们肉眼所见的白光（如日光等）和各种有色光，实际上都是包
含一定波长范围的复合光（polychromaticlight）。
物质呈现的颜色与光有着密切的关系。
一束白光（日光、白炽电灯光、荧光灯光等）通过三棱镜，可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种色光，这种现象称光的色散。
实验证明，不仅这七种色光可以混合组成白光，图10-1
处于直线关系的两种单色光按一定强度比例混合，也可组成白光。
这两种单色光就称为互补色，如绿光和紫光互补，蓝光和黄光互补，等等。
当一束光照射某物质时，若该物质的分子（或离子）与光子发生有效碰撞，则光子的能量就转移到分子（或离子）上，
后通过下面两种方式放出吸收的能量返回到基态：
M（基态）+hvtM（激发态）
由于分子的能级是量子化的，因此分子吸收能量同样具有量子化的特征，即用不同波
长的光照射物质时，其分子只选择吸收具有与其能级间隔相应的波长的光子的能量，其余波长的光只是简单透过，这就是该物质分子对光的选择性吸收特征。
物质呈现不同的颜色正是由于物质分子选择性地吸收了某一波长范围的光而造成的。
固体物质呈现不同的颜色是由于其对
表10-1物质颜色（透过光）与吸收光颜色的互补关系
物质颜色
吸收光
物质颜色
吸
收光
颜色
波长入/nm
颜色
波长入/nm
黄绿
紫
400~450
紫
黄绿
560〜580
黄
蓝
450〜480
蓝
黄
580〜600
橙
绿蓝
480〜490
绿蓝
橙
600~650
红
蓝绿
490~500
蓝绿
红
650〜750
紫红
绿
500~560
任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不同的。
溶液对各种单色光的吸收程度
用吸光度A（absorbanee）来描述。
以波长入（单位nm）为横坐标，以测得的吸光度A为纵坐标，可得一条曲线，称为吸收曲线（absorptioncurve）。
吸收曲线清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。
如
图10-3所示，曲线a、b、c分别是浓度为
-1-1-1,,
0.0002mgml、0.0004mg-ml、0.0006mg-ml的1,
10-邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线。
在入=510nm
处，吸光度A最大，所对应的波长称为最大吸收波长入max。
不同物质的吸收曲线的形状和最大吸收波长不同，说明光的吸收与溶液中物质的结构有关，根据这
一特性可用作物质的初步定性分析。
不同浓度的同一
图10-31,10-邻二氮杂菲亚铁
溶液的吸收曲线
物质，吸光度随浓度的增加而增大，尤其在最大吸收峰附近吸光度的变化更加明显。
若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。
因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。
10.1.2光吸收的基本定律
吸光光度法进行定量分析的理论依据是朗伯-比耳定律。
如图10-2所示，当一束平行
单色光（光强度I。
）通过厚度为b的均匀、非散射的溶液时，溶液吸收了光能，光的强度就要减弱。
溶液的浓度越大，液层越厚，则光被吸收得越多，透过溶液的光强度（即透射光的强度IJ越弱。
溶液的吸光度A与光强度的关系如下：
I0
A=lg”（10-1）
1t
透光度T描述入射光透过溶液的程度：
It
T-（10-2）
I0
透光度的负对数即为吸光度：
A=-lgT（10-3）
实践证明，溶液对光的吸收程度与该溶液的浓度、液层厚度以及入射光的强度等因素有关。
如果保持光强度不变，则光的吸收程度与溶液的浓度和液层厚度有关。
1760年朗伯（Lambert）提出溶液的浓度一定时，溶液对光的吸收程度与液层厚度成正比；1852年比耳（Beer）又提出光的吸收程度与吸光物质浓度成正比。
二者的结合称朗伯-比耳定律，其数学表达式为：
A=£bc（10-4）
式中A:
吸光度；
b:
液层厚度（光程长度），单位cm;
c：
物质的量浓度，单位molL-1；
£:
摩尔吸光系数，单位Lmol-1cm-1。
摩尔吸光系数£是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。
在温度和波长等条件一定时，£仅与吸光物质本身的性质有关，因此，摩尔吸光系数£可作为物质定性鉴定
的参数。
同一物质在不同波长下的£是不同的，在最大吸收波长入max处的摩尔吸光系数常
以£max表示。
£max表明了该吸光物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可
能达到的最大灵敏度。
£max值越大，表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的
灵敏度越高。
一般£max的值在104〜105Lmol-1cm-1为灵敏度较高。
由£=A/bc可以看出，摩尔吸光系数£在数值上等于浓度为1molL-1、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。
但由于光度法只适用于测定微量组分，不能直接测得像1molL-1这样高浓度溶液的吸光度，因此，通常根据低浓度时的吸光度间接计算求得摩尔吸
光系数£。
朗伯-比耳定律广泛应用于紫外、可见、红外光区的吸收测量。
该定律不仅适用于溶液，
也适用于其他均匀、非散射的吸光物质（包括气体和固体）。
对于多组分体系，若体系中各组分间无相互作用，则各组分i的吸光度A有加和性。
设体系中有n个组分，则在任一波长入处的总吸光度A为：
A=A什A2+…+Ai+…=£1bc1+£2bc2+…+£ibci+…（10-5）
例10-1浓度为5.010-4gL-1的Fe2+溶液，与1,10-邻二氮杂菲反应生成橙红色配合物，该配合物在
508nm、比色皿厚度2.0cm时，测得A=0.19。
计算1,10-邻二氮杂菲亚铁的£。
解根据A=£bc
平衡。
按照朗伯-比耳定律的假定，所有的吸光质点之间不发生相互作用。
但实验证明只有在
稀溶液（c：
：
：
10-2molL-1）时才基本符合。
当溶液浓度较大时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了它对光的吸收。
因此，朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。
另外，溶液中存在着解离、缔合、互变异构、配合物的形成等化学平衡，化学平衡与
浓度、pH等其他条件密切相关。
不同条件可导致吸光质点浓度变化，吸光性质发生变化而
偏离朗伯-比耳定律。
例如，在铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：
2-+2-
2CrO4+2H—CQ+H2O
CrO42-、62O72-的颜色不同，吸光性质也不同。
用光度法测定CrO42-或C^O?
2-含量时，溶液
浓度及酸度的改变都会导致平衡移动而发生对朗伯-比耳定律的偏离，为此应加入强碱或强
酸作缓冲溶液以控制酸度，如用光度法测定O.OOImolL-1HCIO4中的心。
「2。
7溶液及0.05
molL-1KOH中的K2CQ4溶液，均能获得非常满意的结果。
10.2可见光分光光度法
10.2.1分光光度计的基本部件
可见光分光光度法采用棱镜或光栅等色散元件构成单色器得到纯度较高的单色光。
分光光度法采用分光光度计测量溶液的透光度或吸光度。
其基本原理是：
光源发射的光经单色器获得实验所需的单色光，再透过吸收池照射到光电元件（光电管或光电池）上，所产生的光电流大小与透射光的强度成正比，通过测量光电流强度即可得到溶液的透光度或吸光度。
分光光度计的种类和型号繁多，其基本部件如下：
光源t|单色器|t|吸收池|t|检测系统
（1）光源
在可见光区测量时，一般用钨丝灯作光源。
钨丝加热到白炽时，其辐射波长范围约320nm〜2500nm。
温度升高，辐射总强度增大，在可见光区的强度分布也增大，但同时会减少灯的寿命。
碘钨灯通过在灯泡内引入少量碘蒸气较好地克服了这一缺点，具有更大的发光强度和更长的使用寿命。
在近紫外-可见分光光度计中广泛用碘钨灯作光源。
要保持光
源的稳定性，必须配有很好的稳压电源。
（2）单色器
单色器（monochromator）是能将光源发射的连续光谱（复合光）分解为单色光并从中选出任一波长单色光的光学系统，一般由棱镜或光栅等色散元件以及狭缝和透镜组成。
图10-6为棱镜单色器示意图。
当一束平行光通过棱镜后，因发生折射而色散。
色散后的光被聚焦在一个微微弯曲并带有出射狭缝的表面上，转动棱镜或移动出射狭缝的位置，就可使所需波长的光通过狭缝进入吸收池。
单色光的纯度取决于色散元件的色散特性和出射狭缝的宽度。
使用棱镜单色器可以获得纯度较高的单色光（半峰宽5〜10nm）,且可以方便地改变测定波长。
在380〜800nm区
域，采用玻璃棱镜较合适。
光栅根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。
它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。
目前多数精密分光光度计已采用全息光栅。
（3）吸收池
吸收池（absorptioncell）又称比色皿，用于盛装溶液，按其液层厚度分为0.5、1、2、
3cm等。
比色皿具有光学洁净的一对互相平行并垂直于光束的光学窗。
可见光区测量时一般用玻璃吸收池，有些塑料池也可在可见光区使用。
使用比色皿时应注意保持清洁、透明，
避免磨损透光面。
（4）检测系统
检测器通常是利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管和光电倍增管。
（5）结果显示记录系统
早期的单光束分光光度计常采用悬镜式光点反射检流计测量光电流，其读数标尺上有两种刻度，等刻度的透光度T%（0~100%）和非等刻度的吸光度A（mt0）,如图12-7
所示。
当吸光度较大时，读数误差较大。
20世纪80年代后，采用屏幕显示（吸收曲线、
操作条件和结果均可在屏幕上显示出），并利用微机进行仪器自动控制和结果处理，提高了
仪器的自动化程度和测量精度。
10.2.2显色反应及其影响因素
有些物质本身具有吸收可见光的性质，可直接用可见光分光光度法测定。
但大多数物质本身在可见光区没有吸收或虽有吸收但摩尔吸光系数很小，因此不能直接用光度法测定。
这时就需要借助适当试剂，与之反应使其转化为摩尔吸光系数较大的有色物质后再进行测定，此转化反应称为显色反应，所用试剂称为显色剂。
显色反应可分为氧化还原反应和配位反应，其中配位反应是最常用的显色反应。
（1）显色反应及其选择
（1.1）灵敏度高
有色物质摩尔吸光系数£大小是显色反应灵敏度高低的重要标志，应当选择生成的有色物质的摩尔吸光系数£大于104lmol-1cm-1的显色反应。
（1.2）选择性好
选择性好，指显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。
仅与某一组分发生反应的特效（或专属）显色反应几乎不存在，往往所用的显色剂会与试样中共存组分不同程度地发生反应而产生干扰。
在分析工作中，尽量选用干扰少（即选择性高）或干扰易除去的显色反应。
高选择性的获得也可借助于加入掩蔽剂、控制反应条件等措施。
一般来讲，
在满足测定灵敏度要求的前提下，常常根据选择性的高低来选择显色剂。
（1.3）显色剂在测定波长处无明显吸收
显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白较小，可以提高测定的准确度。
通常把显色剂与有色化合物两者最大吸收波长之差△入max称为"对比度”，一般要求对比度△入ma:
在60nm以上。
（1.4）生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定
这样可以保证在测定过程中吸光物质不变，否则将影响吸光度测量的准确度和重现性。
利用氧化还原反应进行显色的例子很多。
如光度法测定钢中微量锰的含量，钢样溶解后得到的Mn2+近乎无色，不能直接进行光度测定，采用氧化还原法显色，如用过硫酸盐将Mn2+氧化成MnO4-：
2+2--2-+
2Mn+5S2O8+8H20=2MnO4+10SO4+16H
即可在525nm处进行测定。
（2）显色剂
无机显色剂与金属离子形成的配合物在稳定性、灵敏度和选择性方面较差，一般较少使用。
目前仍有一定实用价值的无机显色剂仅有硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。
更实用的是有机显色剂，它能与金属离子形成稳定配合物，具有较高的灵敏度和选择性。
有机显色剂及其产物的颜色与其分子结构有密切关系。
分子中若含有一个或一个以上某些不饱和基团（共轭体系）的有机化合物，往往是有颜色的，这些基团称为发色团（或生色团），如偶氮基（-N=N-）、醌基
（一）、亚硝基（-N=O）、硫碳基（”C=S）等。
另外，有些含孤对电子的基团，如-NH2、-NR2、-OR、-OH、-SH、-Cl、-Br等，虽
本身没有颜色，但它们的存在却会影响有机试剂及其与金属离子的反应产物的颜色，这些基团称为助色团。
有机显色剂一般含有多个生色团和助色团，当金属离子与有机试剂形成配合物时，由于助色团的影响，通常会发生电荷转移跃迁和配合物内电子跃迁，使产物的最大吸收波长红移，颜色加深，产生很强的紫外-可见吸收光谱。
有机显色剂的种类繁多，其结构及具体应用可参见有关书籍。
（3）显色反应条件的选择
显色反应往往会受显色剂的用量、体系的酸度、显色反应温度、显色反应时间等因素影响。
合适的显色反应条件一般是通过实验来确定的。
（3.1）显色剂用量
为保证显色反应进行完全，需加入过量显色剂，但也不能过量太多，因为过量显色剂的存在有时会导致副反应发生，从而影响测定。
确定显色剂用量的具体方法是：
保持其他条件不变仅改变显色剂用量，分别测定其吸光度，以显色剂浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制A-Cr曲线，可得图10-8所示的几种情况。
图中（a）是显色剂用量达到一定量后吸光度变化不大，显色剂用量可选范围（图中XY段）较宽；（3与（a）不同的是显色剂过多会使吸光度变小，只能选择吸光度大且平坦的范围（XV，段）；（c）的吸光度随显色剂用量的增加而增大，这可能是由于生成颜色不同的多级配合物造成的，这种情况下必须非常严格地控制显色剂的用量。
，酸度变化
（3.2）反应体系的酸度
酸度对显色反应的影响是多方面的。
许多显色剂本身就是有机弱酸（碱）
会影响它们的解离平衡和显色反应能否进行完全；另外酸度降低可能使金属离子形成各种形式的羟基配合物乃至沉淀；某些逐级配合物的组成可能随酸度而改变，如Fe3+与磺基水杨酸的
显色反应，当pH为2〜3时，生成组成为1:
1的紫红色配合物；当pH为4〜7时，生成组成为1:
2的橙红色配合物；当pH为8〜
10时，生成组成为1:
3的黄色配合物。
pH范围中选择。
控制溶液酸度
一般确定适宜酸度的具体方法是在相同实验条件下，分别测定不同pH条件下显色溶液的吸光度。
通常可以得到如图所示的吸光度与pH的关系曲线。
适宜酸度可在吸光度较大且恒定的平坦区域所对应的的有效办法是加入适宜的pH缓冲溶液，但同时应考虑由此可能引起的干扰。
（3.3）显色反应的温度
多数显色反应在室温下即可很快进行，但有些显色反应需在较高温度下才能较快完成。
这种情况下需注意升高温度带来的有色化合物热分解问题。
适宜的温度也是通过实验确定的。
（3.4）显色反应的时间
时间对显色反应的影响需从以下两方面综合考虑。
一方面要保证足够的时间使显色反应进行完全，对于反应速率较小的显色反应，需显色时间长些。
另一方面测定工作必须在
有色配合物的稳定时间内完成。
适宜的显色时间同样需通过实验做出显色温度下的吸光度
时间曲线来确定。
（3.5）溶剂
由于溶质与溶剂分子的相互作用对可见吸收光谱有影响，因此在选择显色反应条件的同时需选择合适的溶剂。
一般尽量采用水相测定。
如果水相测定不能满足测定要求（如灵敏度差、干扰无法消除等），则应考虑使用有机溶剂。
如[Co（NCS）4广在水溶液中大部分解
离，加入等体积的丙酮后，因水的介电常数减小而降低了配合物的解离度，溶液显示配合物的天蓝色，可用于钴的测定。
对于大多数不溶于水的有机物的测定，常使用脂肪烃、甲醇、乙醇和乙醚等有机溶剂。
（3.6）共存离子的干扰及消除
若共存离子有色，或与显色剂形成的配合物有色将干扰待测组分的测定。
通常采用下列方法消除干扰。
1加入掩蔽剂。
如光度法测定Ti4+，可加入H3PO4作掩蔽剂，使共存的Fe3+（黄色）
生成无色的[Fe（PO4）2]3-，消除干扰。
又如用铬天菁S光度法测定Al3+，加抗坏血酸作掩蔽
剂将Fe3+还原为Fe2+,从而消除Fe3+的干扰。
掩蔽剂的选择原则是：
掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。
2选择适当的显色条件，如酸度等以避免干扰。
3分离干扰离子。
在不能掩蔽的情况下，一般可采用沉淀、有机溶剂萃取、离子交换和蒸馏挥发等分离方法除去干扰离子，其中以有机溶剂萃取在分光光度法中应用最多。
另外，选择适当的光度测量条件（如合适的波长与参比溶液等）也能在一定程度上消除干扰离子的影响。
10.2.3吸光度测量条件的选择
光度法测定中，除了需从试样角度选择合适的显色反应和显色条件等，还需从仪器角度选择较佳的测定条件，以尽量保证测定结果的准确度。
（1）入射光波长的选择
在最大吸收波长入max处不仅能获得高灵敏度，而且还能减少由非单色光引起的对朗伯-比耳定律的偏离。
因此，在光度法测定中一般选择入max作入射波长。
但若在入max处有共存离子干扰，则可考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。
如图10-10
所示，1-亚硝基-2-萘酚-3,6磺酸显色剂及其钴配合物在420nm处均有最大吸收，如在此波长测定钴，则未反应的显色剂会发生干扰而降低测定的准确度。
因此，必须选择在500nm处测定，在此波长下显色剂无吸收，而钴配合物则有一吸收平台。
用此波长测定，
灵敏度虽有所下降，但可以消除干扰，提高测定的准确度和选择性。
有时为测定高浓度组分，也选用灵敏度稍低的吸收波长作为入射波长，保证标准曲线有足够的线性范围。
（2）参比溶液的选择
在吸光度测定中，将发生反射、吸收和透射等作用，由于溶液的某种不均匀性所引起的散射以及溶剂、试剂（如显色剂、缓冲溶液、掩蔽剂等）对光的吸收，会导致透射光强度的减弱，为使光强度减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关，单波长分光光度计采用参比溶液进行校正。
即在相同的吸收池中装入参比溶液，调节仪器使吸光度为零（称工作零点）待测溶液的吸光度A=lg□、lg上比，实质是以通过参比皿的光强度为入射光强度，这样
It1试液
测得的吸光度才能真实地反映待测物质对光的吸收。
参比溶液的选择一般为：
1若仅待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有吸收，而被测试液、显色剂及其
他试剂均无吸收，则可用纯溶剂作参比溶液。
2若显色剂或其他试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，则可用“试剂空
白”（不加被测试样的试剂溶液）作参比溶液。
3若待测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，可用“试样空白”（不
加显色剂的被测试液）作参比溶液。
4若显色剂、试液中其他组分在测定波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂作为参比溶液。
（3）吸光度读数范围的选择
对于给定的分光光度计，其透光度读数误差△T是一定的（一般为土0.2%〜土2%）。
但由于透光度与浓度的非线性关系，在不同的透光度读数范围内，同样大小的读数误差厶
T所产生的浓度误差△c是不同的。
根据朗伯一比耳定律
A=lg*二TgT二bc
TgT-；bc
0.434
-dlgT〒dT=bdc
dc0.434-
dT
cTlgT
（10-6）
即
将上式微分
两式相除得
以有限值表示可得
主=0434,t
cTlgT
式中兰表示浓度测量值的相对误差。
式（
10-6）表明，浓度的相对误差不仅与仪器的透
光度读数误差△T有关，而且与其透光度T的值有关。
假设仪器的△T=±0.5%，则可绘
，c
出溶液浓度相对误差——（只考虑正值时）与其透光度T
C
用数学上求极值的方法可求出浓度相对误差最小
值。
△T=±0.5%时，浓度测量的相对误差（只考虑正值时）最小值为1.4%，相应的透光度Tmin=0.368，吸光度Amin=0.434。
由图可见，浓度的相对误差与透光度读数有关。
当
△T=±0.5%时，T落在10%〜70%（吸光度读数A在1.0〜
0.15）范围内，浓度测量的相对误差较小，约为1.4%〜
2.2%。
光度测量时，吸光度读数过高或过低，浓度测量的相对误差都将增大。
因此，普通分光光度法不适用于高含量或极低含量组分的测定。
在上述讨论中，我们假定透光度的绝对误差厶T与
透光度值无关，△T是由仪器刻度读数所引起的误差。
实际上由于仪器设计及制造水平不同，△T可能不同。
影响透光度测量误差的因素很多，难以找到误差函数的
准确表达式，实际工作中应参照仪器说明书，具体问题具体分析，创造条件使测定值在适宜的吸光度范围内进行。
通常采取的措施还有控制待测溶液的浓度（如浓溶液稀释）和选
择合适厚度的吸收池。
（4）提高光度测定灵敏度和选择性的途径
虽然光度法本身灵敏度较高，但是对一些痕量组分的测定还需提高灵敏度。
另外，许多显色反应的选择性不高，故测定复杂组分试样受到限制。
提高测定的灵敏度和选择性可以采用多种途径，如合成新的高灵敏度有机显色剂，采用多元配合物显色体系，采用分离富集和测定相结合。
读者可参阅有关书刊。
10.3可见光分光光度法的应用
分光光度法主要用于微量组分含量的测定，也可以用于高含量组分的测定、多组分分析，以及研究化学平衡和配合物组成的测定。
10.3.1高含量组分的测定一一示差法
光度法广泛应用于微量组分的测定，对于常量或高含量组分的测定无能为力，这是因为当待测组分浓度高时会偏离朗伯-比耳定律，也会因测得的吸光度值超出适宜的读数范围
产生较大的测量误差。
若采用示差分光光度法（简称示差法），则能较好地解决这一问题。
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