整理作物抗病性鉴定.docx
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整理作物抗病性鉴定
实验六作物抗病性鉴定
作物抗病性鉴定（evaluationofdiseaseresistance）是作物抗病育种的重要基础，从抗原筛选、后代选择、直到品种推广的全过程都离不开抗病性鉴定。
狭义的抗病性鉴定是评价寄主品种、品系或种质对特定病害抵抗或感染程度，广义的抗病性鉴定还应包括病原物的致病性评价。
鉴定方法包括自然鉴定、接种鉴定、田间成株鉴定、室内苗期鉴定、离体鉴定及间接鉴定等，在实际工作中则需根据作物、病害种类，目的要求和设备条件而定。
常用方法如下：
1、田间自然鉴定自然发病条件下的田间鉴定是鉴定抗病性的最基本方法，尤其是在各种病害的常发区，进行多年、多点的联合鉴定是一种有效方法。
它能对育种材料或品种的抗性进行最全面、严格的考验。
田间鉴定的方法因作物种类而异，大田作物的田间鉴定一般要进行人工接种，接种方法又因病菌而异。
对于稻瘟病等气传病害，可分别用涂抹、喷雾及注射等方法进行接种，以使具有抗接触、抗侵入等抗病机制的品种也得以发病。
2、温室或田间接种鉴定这种方法是将病原菌孢子或病毒直接接种到温室或田间植株的叶片、果实或根上，它适合对所有作物进行抗病性鉴定。
由于抗病现象是寄主、病原物及环境条件三者共同作用的结果，因此，这种鉴定结果也能真实地反映被鉴定材料的抗病性，可靠性强。
接种鉴定的技术规程包括育苗、接种体的制备（病菌的分离、保存与抱子诱发）及接种3个环节，接种的方法有点滴法、喷雾法、摩擦法及注射法等。
3、离体接种鉴定为鉴定以组织、细胞或分子水平的抗病机制为主的病害，可选用离体接种鉴定。
具有操作简便，鉴定结果可靠等优点。
可同时分别鉴定同一材料对不同病原菌的抗性。
因直接从植株上取下子叶、叶片或果实进行鉴定，不影响幼苗正常生长发育和开花结实。
鉴定方法不仅因作物、病菌种类而异，而且抗病性分级标准也因作物、病原菌的种类不同而存在很大的差别。
以下则针对水稻稻瘟病、小麦条锈病、玉米大斑病等部分主要作物的最重要病害分别学习各种鉴定方法和技术。
I水稻苗瘟抗性的鉴定
一、实验目的
1、熟悉水稻苗期稻瘟病的症状特征。
2、学习和初步掌握水稻苗瘟抗性鉴定技术。
二、内容说明
水稻稻瘟病是一种世界性的真菌病害，被列为水稻三大病害之首。
水稻稻瘟病具有传播快、发生范围广、流行频率高、灾变严重等特点。
在我国水稻各稻区常年均有不同程度的发病，给水稻生产带来极大的损失。
稻瘟病原菌（图6-1）为稻梨孢菌（Pyricularicoryzae），无性世代：
PyrculariagriseaSacc.，半知菌亚门梨孢属。
有性世代：
MagnaporthegriseaBarrYaegash，子囊菌亚门。
分生孢子梗不分
枝，从寄主表皮或气孔伸出，具2~8个
隔膜，基部稍膨大，淡褐色，向上色淡，图6-1稻瘟病原菌
顶端曲状，上生分生孢子。
分生孢子无色，洋梨形或棍棒形，常有1~3个隔膜，基部有脚胞。
我国稻瘟病菌有7群43个生理小种，为ZA群、ZB群、ZC群、ZD群、ZE群、ZF群和ZG群，其中ZG小种为优势小种，分布最广。
稻瘟病在水稻整个生育阶段皆可发生，具有为害时间长、侵染部位多和症状多样性等特点。
按其为害时期和部位的不同，可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟，其中以穗颈瘟对产量的影响最大。
稻株容易感病的生育期是4叶期、分蘖期和抽穗期。
品种是稻瘟病发生和流行的基础。
稻瘟病菌群体大、繁殖快，其高度的变异性使新的生理小种不断更替出现，导致选育的高抗品种很容易丧失抗性。
因此，必须坚持长期研究病原菌的变化，并不断地选育新的抗病品种。
温度和湿度是影响稻瘟病发生流行的主要环境条件，以气温为25~28℃对菌丝发育、分生孢子形成最为适宜，相对湿度96%最适合病菌孢子的形成和侵入。
阴雨连绵，日照不足或时晴时雨，或早晚有云雾或结露条件，病情扩展迅速。
光照对孢子形成、萌发及侵入都有抑制作用，缺氧时孢子不能萌发。
在饱和湿度和适温条件下，病菌侵入稻叶后经4d的潜育期就可出现病斑。
偏施过施氮肥有利发病。
放水早或长期深灌根系发育差，抗病力弱发病重。
稻瘟病的抗性鉴定方法可分自然诱发鉴定和人工接种鉴定两种。
其中人工接种鉴定根据菌株的接种方式不同，又可分为：
①抗谱测定，即多个菌株单个接种；
②多个菌株混合接种。
自然诱发鉴定适于苗瘟、叶瘟穗、颈瘟和枝梗瘟鉴定，人工接种鉴一般适于对苗瘟和叶瘟的鉴定。
一般来说，苗瘟与穗瘟有极显著正相关，因而抗瘟性鉴定常采用苗期人工接种鉴定。
但人工接种鉴定时，一般应用多个种群代表小种的混合菌种，以增加鉴定准确性和普遍性。
三、材料仪器药品
1．供试材料
⑴供试水稻育种材料若干以及抗病对照品种和感病对照品种各一个。
⑵供试稻瘟病菌菌种从当地搜集分布广、致病力强的主要稻瘟病菌的代表性生理小种若干个。
分别进行小种培养繁殖。
2．仪器用品
⑴病菌培养器具高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、恒温培养箱、三角瓶（或茄子瓶）、培养皿、接种环、搪瓷盆、纱布等。
⑵菌液接种和制备器具显微镜、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、普通专用喷雾器或医用喉头喷雾器、医用皮下注射器、橡胶管和保温、保湿的遮荫设备。
3．病菌培养基
⑴酵母淀粉琼脂培养基（酵母2g、可溶性淀粉10g、琼脂15~20g，加水1000ml）。
⑵大麦或高粱种子。
四、方法步骤
（一）人工接种鉴定
1．菌种制备将供试稻瘟病菌菌种各生理小种分别培养，混合接种。
2．病原菌培养繁殖培养方法包括一级培养繁殖和二级培养繁殖两个步骤：
⑴一级培养繁殖采用酵母淀粉琼脂培养基培养。
方法为：
将琼脂10~15g放入1000ml水中加热溶化，再加可溶性淀粉（或煎糖）10g，酵母2g，装入试管，经消毒灭菌后，取出制成斜面，接种病原菌，放在26~28℃恒温箱中培养10d左右即可取用。
⑵二级培养繁殖将病原菌转移到大麦（或高粱）粒培养基上进行培养扩大繁殖，用于接种鉴定。
其方法是将大麦粒加水后煮到半熟状态或用水浸泡24h，然后倒去多余的水分，装入三角瓶内（或茄子瓶），高压灭菌，灭菌后立即将麦粒摇散防止结块。
然后在无菌操作条件下接种病菌，放在26~28℃恒温箱内培养。
培养4~5d时应摇动三角瓶内的大麦粒，使菌丝生长均匀。
待灰色菌丝长满大麦粒并开始变黑时，用自来水冲洗大麦粒上的菌丝，随后摊放薄层于搪瓷盘中，盘上覆盖1~2层纱布以保湿，置于25~28℃变温条件下培养2d左右，即可见到麦粒上产生大量灰色的分生孢子，就可供接种使用。
扩大繁殖时，应注意搪瓷盘内的湿度不宜过高，否则只长菌丝，较少产生分生孢子。
3．育秧
⑴前期准备每个盘中同时安排感病和抗病品种作对照。
将各供试水稻材料的种子进行粒选，各取30~40粒种子，经消毒、冲洗、催芽后准备播种。
⑵培育方法在盛有肥沃泥土的搪瓷盘中育秧。
幼苗2叶期定株，每个材料选留10株生长一致的秧苗。
定株后酌施2~3次氮肥，最后一次施氮肥应在接种前3~4d施用，使幼苗生长嫩绿。
如采用注射接种鉴定法，可在秧田中育秧，移植于大田后进行接种鉴定。
4．接种
⑴喷雾接种一般在3~4叶期。
日平均气温25~28℃和阴雨高湿，叶面长时间（12h以上）常有水珠的时期接种，最有利于发病。
具体步骤是：
将产生不同病菌小种孢子的大麦粒放入盛有自来水的烧杯中搅拌，分别配制成孢子悬浮液，用100倍显微镜检孢子密度，平均每个视野应有孢子20~25个（孢密度则为20~25万个/ml）。
然后将不同生理小种的孢子悬浮液混合，用于接种。
采用专用喷雾器喷雾接种。
喷雾时要将叶片充分均匀湿润。
接种后，在26~28℃下，用薄膜覆盖保湿24小时。
然后移至室外，在20~30℃下保持高湿，培养7天，进行病情鉴定。
⑵注射接种：
一般在水稻6~7叶期分蘖进行，接种的分蘖必须有一张未展开的嫩心叶。
将按上述方法配制好孢子悬浮液，使用医用皮下注射器从叶鞘外侧注入孢子悬浮液，直到多余菌液从心叶中冒出为止。
接种后7d调查植株的发病情况。
（二）自然诱发鉴定
该方法适于多雾天气和阴雨的条件下的稻瘟病重病区，可种植鉴定材料，采用自然诱发抗病鉴定。
具体操作：
将鉴定材料种植在重病区肥沃土壤上，施氮水平略高于当地丰产田。
如有必要可进行人工田间接种，以诱导发病。
每个鉴定材料一般栽植10~20丛，可移栽或直播，重复三次。
以当地抗、感品种作对照。
在鉴定区周围应种植若干行咸感病的品种作诱发行，以增加感染强度。
保持高湿条件。
（三）病情鉴定
一般是接种后7d即进行病情鉴定，或当感病对照品种达到高度发病时调查。
并按全国水稻稻瘟病抗病性鉴定分级标准（见表6-1）逐株鉴定和记载，
表6-1苗瘟和叶瘟抗性分级标准
级别
抗性类型
症状
R
M
S
抗病
中抗
感病
叶片上未见病斑或产生针头状或稍大褐点
叶片上产生圆形或椭圆形病斑，中间灰白色，边缘黄褐色，病斑大小在两叶脉之间，病斑直径在3mm以内
叶片上产生典型梭型病斑，中心灰白色，边缘黄褐色，病斑超过两条叶脉间的宽度
然后用加权法求其平均病级。
国际水稻研究所采用10级制稻瘟病抗性分级标准（见表6-2）。
表6-2苗叶瘟抗性分级标准（IRRI）
病级
受害情况
抗性水平
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
叶上无病斑
病斑为针头大小的褐点
褐点稍大
圆形至椭圆形的灰色病斑，边缘褐色，病斑直径1~2mm
梭形病斑，长1~2cm，通常局限于两条叶脉间，受害面积不超过叶面积的2%
梭形病斑，受害面积不超过叶面积的10%
梭形病斑，受害面积为叶面积的11~25%
梭形病斑，受害面积为叶面积的26~50%
梭形病斑，受害面积为叶面积的51~75%
全叶枯死
高抗（HR）
抗（R）
中抗（MR）
感（MS）
感（S）
高感（HS）
五、实验作业
1．分组进行稻瘟病的苗期人工喷雾接种鉴定。
先配制病菌孢子悬浮液，在100倍显微镜下检查孢子液浓度，即检查3个视野内的孢子数，明确是否符合所要求的孢子悬浮液。
2．进行喷雾接种和喷雾接种后的保温、保湿和遮光等管理工作。
3．接种7d后，进行发病情况检查，确定供试水稻品种的抗性。
4．水稻抗瘟性鉴定应注意哪些问题?
II小麦条锈病抗性鉴定
一、实验目的
1、熟悉小麦条锈病的症状特征。
2、学习和初步掌握小麦条锈病抗性鉴定技术。
二、内容说明
小麦锈病俗称黄疸、麦疸等，分条锈病、叶锈病和秆锈病三种，其中条锈病是我国发生范围最广、危害最重的麦类病害，一般减产25%~75%，也是东北地区限制小麦增产的主要因素。
小麦条锈病主要发生在叶片上，其次为叶鞘和茎上，穗部颖壳和茎上也可发生。
症状如图6-2。
病原菌为条形柄锈菌（PucciniastriiformisWest．），担子菌亚门柄锈菌属。
夏孢子球形或卵圆形，淡黄色，尺度为18~28微米×18~24微米，壁厚l~2微米，表面有微刺，发芽孔排列不规则（如图6-3）。
冬孢子梭形或捧形，双细胞，横隔处有缆缩，顶端平截或略圆，褐色，下端色浅，尺度为30~53微米×12~20微米，顶端壁厚3~5微米，具短柄（如图6-4）。
图6-2条锈病症状图6-3条锈病夏孢子堆图6-4条锈病冬孢子堆
条锈病的发生流行，取决于小麦品种的抗病性、菌源和菌量及气候条件。
选育和栽培抗锈品种是防治小麦锈病危害的一项最基本、最有效的措施，近几年来，随着小麦群体多样化的实施，具有累加毒性、毒性谱更宽的条锈病菌新的毒性小种的不断产生和发展，许多小麦高抗品种逐渐丧失其抗病性，使我国大面积小麦生产品种而临严重的抗性危机。
从事小麦育种工作必须掌握对锈病抗性的鉴定方法。
小麦品种抗条锈病的表现形式，按其对条锈菌的专化性有无，可以划分为专化性抗性和非专化性抗性两大类。
专化性抗性主要表现为过敏性的坏死反应，非专化性抗性一般表现为抗接触、抗侵入、抗扩展以及除过敏性反应以外的其它生理生化抗病特性。
锈病的发生受到小麦材料的抗病能力、病原物的致病力和发病环境的影响，锈病在自然条件下，并非每年每地均严重发生。
因此，在进行抗锈病育种时，除在发病的麦田中进行直接鉴定外，还必须人工接种鉴定，如采用苗期鉴定和成株期鉴定。
一般来说苗期抗病的品种大多数成株期仍然表现抗病，变为感病的只占很小比例，因此苗期鉴定有重要意义。
幼苗鉴定在温室中进行，于充分发病后进行鉴定。
成株期鉴定一般在田间进行。
因小麦条锈病的危害主要在成株期，故鉴定结果最能反应出生产需要。
成株期抗性鉴定在一些条锈病常年发生较重的地区可以依靠自然发病，但为了保证充分发病得到可靠的结果，也有必要进行人工接种。
本实验将选用苗期鉴定和成株期鉴定两种人工接种鉴定。
三、材料仪器
1．供试材料小麦育种材料、感病对照品种、抗病对照品种；供试条锈病菌种（选用致病力强、分布广的不同生理小种）。
2．仪器用具小花盆、试管、培养皿或烧杯、蒸馏水、接种针、玻棒、保湿桶、注射器、喷雾器、塑料薄膜等。
四、方法步骤
（一）幼苗接种该方法可在较短的时间内测定大量材料对锈病的抗病性，便于鉴定不同小麦品种对不同锈病生理小种的抗病性，能防止当地未发现而外地己存在的新的生理小种的传播。
1．育苗在接种鉴定前10d左右，将待鉴定的小麦品种的种子，播种于直径为8~10cm左右的小花盆内。
每盆播种2~3个品种，其中一个品种为易感病的诱发品种，以用作对照。
各品种要相互隔开，插上木签，注明品种名称及播种日期等。
2．接种时间接种适宜时间是在麦苗第一片叶子长达4~5cm时。
3．采集孢子在温室培养的发病植株上，按不同生理小种分别采集新鲜孢子粉，将试管倾斜套进麦株病叶，再轻轻震动，使已成熟的孢子落于管内，达到要求量即可。
4．孢子悬浮液的配制采集不同生理小种的新鲜孢子粉，分别在玻璃杯内用蒸馏水稀释至孢子悬浮液透光呈桔黄色即可。
如果采取混合接种，则各小种的孢子粉事先应等量混合，而后配成孢子悬浮液，现配现用。
5．接种方法一般可用的接种方法有涂抹、喷雾、喷粉等方法，第一种方法主要在繁殖少量菌种或接种少量鉴定材料时应用，后两种方法适于对大量材料的接种鉴定。
但一般常用的是涂抹接种法。
具体操作是：
⑴用洁净的手指蘸清水将麦苗的叶片摩擦数次，去掉叶片表面的蜡质和茸毛，以利于菌液吸附于叶面上。
用消毒过的接种针蘸上配制好的孢子悬浮液，涂抹于麦叶正面进行接种。
然后记录并在木签上注明接种日期及所用菌种。
⑵接种后把麦苗随即放入保湿桶中（即用一铁皮桶，其内盛水，保持99%~100%湿度），再用喷雾器喷降水雾，令麦苗和保湿桶的内壁沾满雾滴。
喷雾不能过量，以防冲掉已接种的锈病孢子。
喷雾后，马上盖严塑料薄膜，把保湿桶放置在适宜的温度条件（最适温度为9~13℃）下，保湿阶段经24h左右。
⑶将麦苗取出，移至阳光充分的温室内，平均温度最好分别控制在16~18℃，光照时间每天应不少于12h，冬季光照不足，需每天增加一定时间的人工辅助光照。
温度和光照掌握的好坏是发病充分与否的关键。
⑷经两周后麦苗即可发病，此时即可鉴定品种的抗病力。
.
注意：
在分别接种不同生理小种进行鉴定时，接种用的一切用具都要先行消毒，防止可能发生的污染影响鉴定结果。
（二）成株接种
1．材料种植把每个被鉴定材料采用凹穴播种法种成一个小区，在鉴定材料圃的四周和在鉴定区内每当隔10~20个小区播种高感品种做为诱发行。
诱发行最好用2~4个高感品种等量混合播种。
2．接种时间接种条锈病的适宜时间，通常是在小麦拔节前后。
3．孢子采集条锈菌配制孢子悬浮液方法同幼苗接种。
4．接种方法一般可用的接种方法有涂抹、注射、喷雾、喷粉等方法，但最常用的是注射接种法：
选择夜间有露傍晚进行。
为了提高田间湿度，接种后和开始发病后，在诱发行上用清水喷雾，或浇水，保证良好的诱发条件。
将配制好的孢子悬浮液吸入注射器在感病诱发行植株的第二可见（从上数）叶片与叶鞘相接处将针头倾斜刺入，切勿刺穿，再稍稍回抽，即行注射孢子液，以见到心叶上端冒出水珠为度。
在诱发行接种，一般每隔1m左右选取单茎3~5个予以注射3~5针。
随即用塑料薄膜覆盖保湿，次日早晨揭开。
（三）抗锈性鉴定观察与记载
衡量小麦品种对锈病的抗性和发病程度，常用反应型、普遍率及严重度三个指标。
⑴反应型是指小麦植株受病菌侵染后的保卫性反应。
是一种定性的记载标准，用常规分级法表示，能较好地反映出品种免疫性的本质。
目测评定，其反应型新标准采用9级制，其分级标准如表6-3。
表6-3小麦品种对条锈菌反应型的分级标准
级别
抗性程度
品种反应的症状
0
1
3
5
7
9
免疫型
近免疫型
高抗型
中抗型
中感型
高感型
叶片健康，没有病害症状
叶片上有点滴枯死斑和失绿反应，但无夏孢于堆
叶片夏孢子堆很小且很少，孢子周围有褪绿和枯死斑
夏孢子堆小到中等，较分散，周围有枯死和失绿反应
夏孢子堆中等大小，数量较多，周围组织无枯死反应，但有失绿现象
夏孢子堆大而多，连成条纹，串连成片，早期叶片既无枯死也无褪绿现象
⑵严重度即病叶上孢子堆占叶面积的百分率，用以表示病害发生的严重程度。
用分级法表示。
一般可分8级，即1%、5%、10%、25%、40%、65%、80%、100%。
一般在田间锈病发展到高峰期时进行鉴定，记载时在1m行中随机取3点，每点记载10~30片顶三叶的实际严重度，求平均严重度。
⑶普遍率指病害发生的普遍程度，即发病叶片数占调查总叶片数的百分率。
一般用目测估计法观测记载。
要求精确鉴定时，可根据被鉴定材料小区面积的大小，可设点随机选取30~50片叶观察记载。
此外，还应观察锈菌的潜育期。
即锈菌从侵入和建立寄生关系到表现明显的症状为止的时期。
潜育期的长短与品种的抗病性有密切的关系，即使同一品种对不同生理小种以及在不
同温度下其潜育期也不同，因而可用来作为鉴定的一种指标。
接种后一般从11d后开始，每天在接菌圃中逐品种检查一次以某一品种有50%顶三叶上孢子堆破裂为标准，记载日期，推算潜育期。
在正常情况下，接种后约经两星期即可发病，抗锈性的病情鉴定时间是小麦乳熟期以后，田间锈病发展到高峰时进行。
每个品种逐个进行鉴定记载。
鉴定小麦品种的抗锈性应以鉴定反应型为主，并目测鉴定普遍率和严重率。
鉴定杂种后代只鉴定反应型。
均按上述分级标准进行评定。
五、实验作业
1．采集条锈病菌新鲜孢子和配制其孢子悬浮液，并按分配任务进行注射接种和做好接种后的田间管理工作。
2．小麦条锈病发病条件是哪些?
在人工接种时怎样保证这些条件?
接种鉴定抗性过程中，容易出现哪些问题干扰鉴定结果？
3．发病盛期对供鉴材料的抗病性进行鉴定，并对抗性进行综合评价分析。
将观察结果填写表6-4。
表6-4小麦条锈病抗病性鉴定结果记录
品种
反应型
严重度
普遍率
潜育期
III玉米大斑病抗性鉴定
一、实验目的
本实验将学习和初步掌握玉米大斑病抗性鉴定技术：
1．玉米大斑病的主要症状特征观察
2．玉米大斑病的接种办法
3．玉米大斑病的病情与抗性级别鉴定
二、内容说明
玉米大斑病（Helminthosporiumturcicum）在中国分布广泛，主要发生在气候较凉爽的玉米种植区，是东北玉米主要病害之一，发生严重。
大斑病菌主要侵染玉米叶片、苞叶和叶鞘。
病害主要发生在玉米抽雄以后，下部叶片首先发病并迅速向上部叶片扩展。
发病初期，叶片上出现水渍状青灰色斑，向两端扩展，形成黄褐色梭形或长纺锤形大斑（如图6-5），影响植株光合作用，造成籽粒灌浆不足，导致产量降低，严重时全株枯死，造成严重损失。
图6-5玉米大斑病典型病斑
病原菌为大斑突脐孢菌Exserohilumturcicum（Pass.）LeonardetSuggs。
有性态：
大斑刚毛球腔菌Setosphaeriaturcica（Luttrell）LeonardetSuggs。
世界已知病原菌有5个生理小种，我国已发现其中3个，分别为0号小种，1号小种，23号小种。
0号和1小种是我国主要玉米产区的优势小种。
抗病育种是防治大斑病最经济有效的措施。
玉米对
图6-6玉米大斑病原菌大斑病抗性表现亦分两种：
一是由多基因控制，表现不同程度的病斑数；一是由单基因控制，产生抗性病斑，表现褪绿病斑或褪绿斑点甚至无病斑。
玉米对斑病抗性水平鉴定和评价是一项专业性强、技术性高的工作，包括一系列的内容。
只有在具备适宜的病原菌、适宜的病害发生环境以及能够较准确反映寄主抗性本质的评价指标的条件下，玉米品种的抗性水平才能得以真实反映。
抗病性鉴定的各个步骤都影响着植株抗性的表达程度和表达真实性。
科学、准确地开展玉米的抗病特性鉴定和抗性评价，是正确评价种质的抗性、在育种过程中合理选择和聚合抗性、在生产中充分利用抗性的重要基础。
玉米抗病性鉴定程序主要包括主要生理小种病原菌的准备，接种时期的选择，最佳的接种方法、抗病性鉴定圃的设立、田间调查观察与记载等步骤和内容。
鉴定玉米育种材料抗大斑病的方法有自然诱发鉴定，大田诱发鉴定和人工接种鉴定。
但以人工接种鉴定较为可靠。
三、材料仪器药品
1．供试材料玉米抗病和感病对照材料，玉米大斑病菌种（1号生理小种）。
2．仪器用具高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、接种环、恒温箱、烧杯、漏斗、试管、纱布、玻璃棒、培养皿、显微镜、小喷雾器、保湿罩等。
3．药品试剂75%酒精、0.1%升汞溶液、葡萄糖、琼脂、马铃薯等。
四、方法步骤
（一）人工接种
1．菌种的培养
⑴病原菌的分离选取新鲜病叶作为分离材料，在灭菌室内进行操作。
先将病斑剪成4~5mm2大小，约30~40块，然后分别将病组织小块置于0.1%升汞溶液中消毒1min，立即取出，按无菌操作方法投入无菌水中清洗三次，每次2~3min。
最后以无菌操作方法，将病斑组织按正方形四点排列，栽种在PDA平板培养基（去皮马铃薯20g，葡萄糖10~20g，琼脂17~20g，水100ml）上，置25~30℃温箱中培养约7d。
⑵菌种的纯化选取培养性状典型的菌落，按无菌操作方法移植到斜面培养基上（每个典型菌落移3管），然后再放在25℃恒温下培养。
待产生孢子后，选取菌落较一致的斜面1~2管，挑取一点，观察孢子的形状、分隔数、脐点特点。
然后计测孢子大小。
确认纯种后，再用斜面培养基扩大培养，让其产生大量孢子后，置冰箱中保存待用。
2．孢子悬浮液的制备将培养物用少量蒸馏水洗下孢子，用纱布滤去菌丝及培养基，滤液用蒸馏水稀释，调至在100倍显微镜下每个视野10个孢子左右为宜。
3．接种时期苗期接种一般在玉米苗龄5~8叶时进行；成株期接种在抽雄前进行。
4．接种方法
⑴苗期接种接种前在孢子液中加入2%蔗糖，以促进孢子萌发。
接种菌液量是每株1~2cm。
用微型喷雾器均匀喷雾，喷后立即覆盖保湿罩，在22℃左右保湿24h。
⑵成株期接种将粉碎的头一年病叶撒入心叶喇叭口，接种应在下午或傍晚湿度较大时进行。
天气干燥时，接种后可在每株心叶喷水。
（二）病情鉴定和分级标准
1．苗期鉴定及标准接种后12d左右进行病情鉴定，鉴定应在同一天内完成。
鉴定项目和标准如下：
⑴发病程度以叶片为单位进行鉴定。
根据病斑占叶片面积的百分率，记载每片叶的感病程度。
发病程度分为九级（见表6-5）。
鉴定接种部位的叶片共20片。
而后，以叶片为单位，计算病叶率和病情指数。
表6-5玉米小斑病叶片发病程度分级标准
等级
病班占叶片面积（%）
0
1
2
3
4
5
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新增加的六个内容是：
风险评价；公众参与；总量控制；清洁生产和循环
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