汉族人维生素D受体基因TruⅠ和FokⅠ多态性与腰椎间盘退变的关系.docx

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汉族人维生素D受体基因TruⅠ和FokⅠ多态性与腰椎间盘退变的关系

汉族人维生素D受体基因TruⅠ和FokⅠ多态性与腰椎间盘退变的关系

【摘要】　　［目的］探讨汉族人维生素D受体基因多态性与腰椎间盘退变的关系。

［方法］收集182例汉族人静脉血标本和腰椎MRI，其中对照组101例，病例组81例。

用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法测定2组标本的VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位点多态性；根据MRI显示的信号差异按Schneiderman分级法确定各个体腰椎间盘的退变程度，分无、轻、中、重4组。

分析病例对照组中基因型、等位基因频率的分布规律，分析其中小于45岁者基因型及基因频率分布与椎间盘退变程度的关系。

［结果］对照组中FokⅠ和TruⅠ的等位基因频率分布为：

F%，f%和T%,t%；病例组中FokⅠ和TruⅠ等位基因频率的分布为：

F%，f%和T%,t%，二组中的分布差别无统计学意义，P＞;在MRI分组中VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位点的基因型和等位基因频率在组中分布差异也无显着性，P＞。

［结论］VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位点多态性和汉族人LDD无关。

【关键词】维生素D受体基因　单核苷酸多态性限制性片段长度多态性腰椎间盘退变

　　AssociationofvitaminDreceptorgeneTruⅠandFokⅠpolymorphismswithlumbardegenerativediscdiseaseinHannationality∥

　　Abstract：

［Objective］ToinvestigatetheassociationofVitaminDReceptorgenepolymorphismstolumbardiscdegnerationinHannationality.［Method］BloodsamplesandMRIfrom182Hanpeoplewerecollected,including81patientswithLDDand101healthy　TruⅠandVDRFokⅠpolymorphismsweretestedbyPCRRestrictionFragmentLengthPolymorphismleveloflumbardiscdegenerationinthecasesyoungerthan45yearsoldwasdeterminedbythesignalintensityonMRIaccordingtoSchneidermansclassificationsystem,anddividedintofourgroups;no,slight,moderate,andsevere　distributionofthegenotypesandallelefrequenciesinthecasecontrolgroupswereanalyzed;thesamedistributionruleintheMRIgroupswerealsoanalyzed.［Result］ThefrequenciesoftheVDRFokⅠandVDRTruⅠallelesinthecontrolgroupwere:

F%,f%,T%,t%,%,f%,T%,t%inthepatientgroups,itshowednostatisticallydifference,P＞;thedistributionintheMRIgroupshadnotdifference,P＞［Conclusion］VDRTruⅠandFokⅠpolymorphismsarenotrelatedtoLDDinHannationality.

　　Keywords：

vitaminDreceptorgene;singlenucleotidepolymorphism;restrictionfragmentlengthpolymorphism;lumbardiscdegeneration

　　腰椎间盘退变可引发多种骨科常见病，包括腰椎间盘突出、椎间不稳、椎间盘源性腰腿痛等一系列以腰腿痛为主要症状的疾病。

近几年研究发现IL1、IL6、胶原基因、TGF和维生素D受体等因子的基因多态性与LDD密切相关〔1〕。

其中VDR基因与骨、软骨代谢关系密切，其多态性与LDD的关系备受关注〔2〕。

本实验中作者通过研究汉族人VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位点多态性与LDD关系，寻找LDD可能的遗传风险因子。

　　1材料和方法

　　测定对象

　　病例组

　　选取2004年11月～2005年2月中山大学附属第二医院、广州军区陆军总医院、广东省中医院骨科门诊及住院无血缘关系的汉族人LDD患者81例。

其中男41例，女40例；平均年龄岁。

所有患者均经MRI检查确诊，病程1周～5年，平均11个月。

排除椎体肿瘤、椎体滑脱、脊柱感染性疾病等。

MRI扫描时为脊柱协同线圈，T2加权像时TE为120ms，TR为3500ms，层厚/层距为/mm。

L3～S1椎间盘退变情况根据MRIT2加权像中椎间盘信号强度变化进行判断。

分级评定按照Schneiderman4级法评分〔3〕：

1级：

椎间盘信号无缺失；2级：

椎间盘信号中度缺失；3级：

椎间盘信号重度缺失；4级：

椎间盘信号完全缺失。

每个对象中椎间盘信号≥2级为退变，3个节段的级数相加为退变总评分。

　　图1按Schneiderman4级评分法左：

L3、4、L4、5、L5S1椎间盘信号分别为1级、2级、3级；右：

分级为1，3，4

　　考虑到肥胖、吸烟、工作方式及其余与遗传有关的疾病的影响，因此排除以下对象：

体重指数大于kg/m2和重度吸烟者;司机、木工等职业工作者；强直性脊柱炎、糖尿病、高血压等病患者。

　　对照组

　　健康志愿者101例，也为无血缘关系的汉族人。

其中男40例，女61例，平均年龄岁。

所有志愿者均行腰椎MRI检查并按分级分组。

排除标准同病例组。

2组检测对象均取得知情同意。

　　主要试剂

　　DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品，引物合成、PCR产物测序由上海英俊基因有限公司完成，TaqDNA聚合酶、dNTP为TaKaRa公司产品，普通及梯度PCR仪均为Biometra公司产品。

MR机为德国西门子公司产品。

限制性内切酶为NEB公司产品。

　　方法

　　DNA提取

　　取抗凝全血5ml，采用酚氯仿法提取基因组DNA。

　　VDRTruⅠ基因型测定〔4〕

　　引物：

A：

5′-GGCAACCTGAAGGGAGACGTA-3；B：

5-CTCTTTGGACCTCATCACCGAC-3。

反应体系：

模板DNA　μl，dNTP2μl，10×缓冲液μl，引物A、B各μl,TaqDNA聚合酶μl，用无菌去离子水补足总体积至25μl。

循环参数为预变性94℃10min，94℃5s，55℃退火10s，72℃延伸15s，35个循环，72℃延伸10min。

扩增片段长度为461bp。

　　取部分扩增产物行分光光度定量，其余产物浓度用凝胶成像法半定量。

按产物的浓度取不同量加入到10μl酶切体系中，加入TruⅠ内切酶U，10×缓冲液1μl，用无菌去离子水补足总体积至10μl，混匀。

反应条件：

65℃水浴6h。

酶切片段与金染料充分混合后分别经%～3%琼脂糖电泳，等位基因t显示361bp和100bp2个片段，等位基因T显示461bp1个片段。

　　VDRFokⅠ基因型测定

　　引物：

A：

5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′；B：

5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTTCCCTC-3′。

反应体系：

模板DNA　μl，dNTP2μl,10×缓冲液μl，引物A、B各μl，TaqDNA聚合酶μl，用无菌去离子水补足总体积至25μl。

循环参数为预变性94℃10min,94℃45s,63℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。

扩增片段长度为265bp。

　　定量方法同上，在10μl酶切体系中加入FokⅠ内切酶U，10×缓冲液1μl，用无菌去离子水补足总体积至10μl，混匀。

反应条件：

37℃水浴24h。

酶切片段与金染料充分混合后分别经%～3%琼脂糖电泳，等位基因f显示169bp和96bp2个片段，等位基因F显示265bp1个片段。

　　统计分析

　　所有数据采用SPSS软件进行统计学处理。

计量资料以x-±s表示，其差异性测定采用t检验，计数资料用x2检验。

组间等位基因和基因型频率差异比较用x2检验；不同基因型与椎间盘退变节段数及椎间盘退变等级评分总和的关系用秩和检验KruskalWallis法进行分析。

　　2结果

　　2组中成员的特征

　　病例组中患者年龄为岁，25岁时体重指数为kg/m2，目前体重指数为kg/m2，对照组中患者年龄为岁，25岁时体重指数为kg/m2，目前体重指数为kg/m2，经t检验，发现2组中年龄、25岁时及目前体重指数差异无显着性。

另外，病例组中轻中度、重度劳动强度者分别为63、18例，对照组中则分别为86、15例，经x2检验，发现2组中患者劳动强度的分布差异亦无显着性。

　　VDR基因型及等位基因频率在病例对照组及MRI分组中的分布

　　在病例组及对照组中，VDRTruⅠ和FokⅠ位点各种基因型及频率分布。

各对照组符合HardyWeinberg定律。

TruⅠ和FokⅠ位点各基因型和基因频率分布经x2检验，差异无显着性。

　　图2电泳后等位基因t出现361bp和100bp2个片段，等位基因T出现461bp1个片段

　　图3电泳后等位基因f出现169bp和96bp2个片段，等位基因T出现265bp1个片段

　　表1病例-对照组中VDRTruⅠ和FokⅠ位点多态性表达情况

　　VDR基因各位点多态性在MRI分组中的分布

　　由于2组中的研究对象均为随机人群，故作者用MRI分析VDR基因多态性及LDD的关系。

为排除年龄因素的影响，我们仅以2组中≤45岁者为研究对象；为排除劳动强度的影响，将所有个体分为轻、中、重3级；腰椎MRI分为无、轻、中和重度4组。

　　经统计显示，VDRTruⅠ和FokⅠ单核苷酸多态性分布在任何一劳动强度层面，各基因型与腰椎间盘退变总节段数及退变总评分均无关。

　　表2VDRFokⅠ单核苷酸多态性与腰椎间盘退变节段数和评分的关系

　　表3VDRTruⅠ位点多态性与腰椎间盘退变节段数和评分的关系

　　3讨论

　　VDR基因经过转录翻译成维生素D受体，介导1，252D3发挥生物效应，是类固醇激素/甲状腺激素受体超基因家族的成员。

其基因定位于人12号染色体，基因序列长约100kb，由11个外显子组成，使用核酸限制性内切酶已发现VDR基因100多种酶切位点多态性。

其中FokⅠ酶切位点位于VDR基因的第2个外显子中，有FokⅠ酶切位点时基因表达的VDR由427个氨基酸残基组成；如果没有FokⅠ酶切位点，基因表达的VDR仅含424个氨基酸残基。

大多数文献表明存在FokⅠ酶切位点的ff型有较低的腰椎骨矿化密度和较高的髋关节骨丢失量，而FF型表达的VDR反式激活作用较强，因而具有较强的生物活性〔5〕。

TruⅠ酶切位点位于VDR基因第8个内含子，虽然不改变VDR的蛋白序列，但转录出VDR基因的mRNA3′末端区域可以影响mRNA的表达和稳定性，影响增强子对靶部位的亲和力。

研究表明VDR基因酶切位点多态性与多种疾病相关，包括骨质疏松、骨关节炎、糖尿病、肿瘤、心血管疾病和慢性牙周病等，而与LDD相关性研究则较少。

　　Videman〔6〕等人收集白种人中85对男性双胞胎的血液标本与胸腰椎MRI，考察VDR基因型与MRI的关系，发现在T6～S1节段，TaqⅠ基因型中Tt与tt型分别比TT型信号低%与%，而FokⅠ基因型中ff和Ff型平均的信号密度分别比FF型要低%和%。

有统计学差异。

后来Cheung等〔7〕考察汉族人TaqⅠ位点和LDD的关系，认为汉族人群VDR基因多态性与腰椎间盘退变存在一定的关联。

由于FokⅠ位点的变异可引起VDR蛋白序列的变化，从而改变VDR的蛋白结构，这种关联性可能更大，因此作者考察FokⅠ位点与LDD的关系，但研究结果却表明汉族FokⅠ位点与LDD退变节段无关，与退变总评分也无关，可能此位点主要影响骨代谢，而对软骨代谢影响较小〔8〕。

另外本实验的结论与Videman等的报道有所不同，造成这种不同的可能原因是一方面与种族不同有关，另一方面也与所选取标本的年龄、劳动强度、饮食结构和生活习惯存在一定关系。

有关TruⅠ的多态性国内外报道很少，YeWZ〔3〕等首先发现这个位点，在白种人群中分布规律为TT%,Tt%,tt%，基因频率为T，t,后来ZajickovaK〔9〕再次证实了这个位点的存在。

此实验中作者用PCRRFLP法测定TruⅠ位点多态性，发现在汉族人中同样也存在TruⅠ多态性，选择对照组分析其基因频率为T,t，表明汉族人t基因频率出现的频率比白种人群t基因频率大，作者首次结合病例-对照组和MRI显示的椎间盘退变程度分析这一位点的多态性与腰椎间盘退变的相关性，结果表明汉族人TruⅠ位点多态性在病例-对照组中分布无差别，与LDD退变节段无关，与退变总评分也无关。

　　LDD的病理基础是椎间盘退变，作者从椎间盘退变引起的椎间盘退变性疾病的角度分析了VDR基因FokⅠ和TruⅠ位点单核苷酸多态性与椎间盘退变的关系，同时利用分层分析，去除劳动强度的影响后分析MRI显示的信号与此2个位点多态性的关系。

结果此2个位点单核苷酸多态性在病例-对照组中分布无差别，与L3、4、L4、5和L5S1椎间盘退变的节段数及椎间盘退变的评分无明显关系。

据此，作者认为汉族人VDR基因FokⅠ和TruⅠ位点单核苷酸多态性LDD的发病基础无关。

但VDR基因其他位点的多态性是否与LDD有关，还需进一步的研究。

【参考文献】

　　〔1〕叶伟，黄东生，刘尚礼，等.IL6基因单核苷酸多态性与腰椎间盘疾病的关联研究［J］.中国病理生理杂志,2006，22:

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　　〔2〕Videman,Tapio,et　polymorphismsofthevitaminDreceptorgeneassociatedwithintervertebraldiscdegeneration［J］.Spine,1998，23:

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　　〔3〕SchneidermanG,FlanniganB,KingstonS,et　resonanceimaginginthediagnosisofdiscdegeneration:

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　　〔5〕UitterlindenAG,FangY,VanMeursJB,et　andbiologyofvitaminDreceptorpolymorphisms［J］.Gene,2004，338:

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　　〔6〕VidemanT,GibbonsLE,BattieMC,et　relativerolesofintragenicpolymorphismsofthevitaminDreceptorgeneinlumbarspinedegenerationandbonedensity［J］.Spine,2001，26:

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　　〔7〕CheungKM,ChanD,KarppinenJ,et　oftheTaqⅠalleleinvitaminDreceptorwithdegenerativediscdiseaseanddiscbulgeinaChinesepopulation［J］.Spine,2006，31:

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　　〔8〕IvanovaJ,DoukovaP,BoyanovM,etⅠandBsmⅠpolymorphismsofthevitaminDreceptorgeneandbonemindraldensityinarandombulgarianpopulationsample［J］.Endocrine,2006，29:

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　　〔9〕ZajickovaK,KrepelovaA,Zofkova　singlenucleotidepolymorphismunderthereverseprimerbindingsitemayleadtoBsmⅠmisgenotypinginthevitaminDreceptogene［J］.JBoneMinerRes,2003，18:

17541757.