（2）与对照组比较，实验组PRA的mRNA量显著下降（P<0。
01），而PRB的mRNA水平
未见明显统计学差异（图3．8）I（3）实验组PRA／PRB的mRNA比值明显下降（图3—8）。
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图3-8RT-PCR检测HDACl过表达质粒转染前后HDACl、PRA、PRB表达的改变HDACl．plasmid为HDACl过表达质粒转染组，vector-control为阴性对照组。
从左到右依次
为HDACl的mRNA水平，PRA和PRB的mRNA水平，PRA／PRB比值。
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万方数据
第三军医大学硕士学位论文
3．2．8Westernblot检测比较转HDAC过表达质粒转染前后HDACl、PRA、PRB
表达改变
Westernblot检测发现：
（1）PRA、PRB、HDACl蛋白在空白对照组和阴性对照组未见明显差异（图3—9）。
（2）与阴性对照组比较，实验组HDACl蛋白表达量升高，PRA蛋白表达量下降，PRB蛋白未见明显差异。
蛋白分析结果与mRNA分析结果一致（图3．9）。
PRB
PRA
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H3
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3．3讨论
近期对多种肿瘤的研究发现，表观遗传修饰可以调控PRs的表达【3l-331。
例如，乳腺癌研究显示HDACl是调控ERa表达的关键因素之一[22,23】。
本研究在组织水平发现，HDACl可能与分娩发动时PRs的差异化表达相关（详见第二章）。
为研究HDACl是否与PRs差异化表达存在关联，我们体外培养原代子宫平滑肌细胞（HUtSMCs），设计实验，展开探索。
首先，我们从妊娠子宫平滑肌组织中分离培养原代细胞，并对原代细胞进行鉴定。
结果显示，原代细胞表达子宫平滑肌细胞蛋白标志物：
Calponin、0【．SMA、Vimentin和SM—MHC，表明原代HUtSMCs培养成功（图3．2、3．3）。
且蛋白标志物在原代细胞
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万方数据
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和妊娠子宫肌组织中表达量相近，表明体外培养的原代细胞能较好代表体内组织状态，提高体外细胞实验的可信度（图3．3）。
同时，我们通过免疫荧光技术检测到HDACl、PR、PRB三种蛋白均定位于细胞核中表达（图3．4）。
进一步，我们构建HDACl过表达质粒和干扰质粒。
通过细胞核转染仪致原代子宫平滑肌细胞胞膜、核膜暂时穿孔，质粒进入细胞内。
电转染虽具转染效率高的优点，但每次转染效率不稳定，因此我们给质粒带上GFP标签，并通过导致显微镜和流式细胞仪检测带GFP标签细胞比例，筛选转染效率60％以上的细胞批次用于后续实验（图3．5）。
克隆于干扰质粒的短发夹RNA（shRNA）通过表达短的干扰RNA，导致针对HDACl基因的特异性、长时间、稳定沉默。
克隆有HDAC合成序列的过表达载体进入细胞，致胞内HDACl水平升高。
研究以未转染质粒的原代细胞为空白对照，空载体质粒为阴性对照，干扰质粒和过表达分别为实验组。
实验结果表明：
干扰质粒转染HUtSMCs后，实验组HDACl显著
下调，同时发现PRA基因的mRNA（图3—6）和蛋白表达量（图3．7），及PRA／PRB比值均升高；过表达质粒使细胞
内HADCl显著升高后，PRA基因的mRNA（图3—8）和蛋白表达（图3—9）量，及PRA／PRB比值均显著下降；而升高或者降低细胞内HDACl，对PRB基因表达无明显影响（图3-6／7／8／9）。
本研究结果从正反两个角度说明：
HDACl可以直接或者间接地调节PRA基因的表达，而对PRB基因无调控作用。
有研究称，ER阴性乳腺癌细胞中，HDAC抑制剂通过增高组蛋白H4乙酰化水平而增强PR基因表达，此种作用具有ERa依赖性【l21。
然而，本实验下调和（或）上调HDACl基因后，仅检测比较了孕激素两个受体的变化，并未对子宫平滑肌细胞内其他基因进行检测，例如，雌激素受体（ER）。
本实验亦未证实HDACl直接作用于PRA基因，或者HDACl通过与其他因子结合共同作用
于PRA基因，或者HDACl调控其他因子，例如ERa，进而间接使PRA基因发生变
化。
接下的研究我们进一步探讨HDACl通过何种机制调控PR表达。
3．4小结
本实验以胶原酶消化法分离培养原代子宫肌细胞；用免疫荧光和westernblot鉴定子宫平滑肌细胞蛋白标志物：
Calponin、0c．SMA、Vimentin和SM—MHC在原代细胞中表达，表明原代HUtSMCs培养成功；设计shRNA干扰序列，构建干扰质粒；合成
HDACl序列，构建过表达质粒；电转染法使质粒进入原代子宫肌细胞沉默HDACl或过表达HDACl，检测PRs表达变化，及PRMPRB比例变化。
结果表明HDACl抑制PRA基因表达，对PRB无相同调控作用。
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第四章HDACl调控PRs的机制研究
4．1材料和方法
4．1．1主要器材及试剂
4．1．1．1实验器材
水浴箱上海精密实验设备有限公司
摇床上海精密实验设备有限公司
磁力架上海精密实验设备有限公司
超声破碎仪上海精密实验设备有限公司4．1．1．2主要实验试剂
CHIP试剂盒赛默飞世尔科技公司
蛋白酶KEpigentek
无水乙醇深圳三品科技
NaAc（5M）上海生工
PCI深圳三品科技
TEbuffer上海生工
Glycogen上海生工
甲醛深圳三品科技
CHIP—qPCR实验引物：
启动子引物：
PRB上游引物：
57一ACGGGTGGAAATGCCAACT-37，PRB下游引物：
5’．GCCCTCCCTACCCCAAT-3’；PRA上游引物：
5’
．CGGTCCAGCCACATTCAAC．3’，PRA下游引物：
5’．ATAGGGGCAGAGGGAGA．3’。
4．1．2主要实验方法
4．1．2．1CHIP（染色质免疫共沉淀）分析HDACl调控PRs机制HDACl干扰质粒和HDACl过表达质粒转染后细胞分别为实验组，空载体质粒转
染后细胞作为阴性对照组。
转染效率大于60％的细胞用于CHIP实验。
质粒转染方法
如第三章所述。
（1）细胞固定
①取实验组细胞漂洗2次，加0．25％胰酶消化细胞，待细胞由梭形变为圆形时加等
体积完全培养基中和胰酶，吹打细胞成单细胞悬液，加培养基到细胞悬液体积达8ml。
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②向细胞悬液中加入36．5％甲醛224ul，使甲醛终浓度达1％，摇床上固定细胞10
分钟。
③1230rmp，7分钟离心，弃上清，保留细胞沉淀。
④加预冷PBS洗细胞沉淀2次。
⑤弃PBS，细胞沉淀用枪头混匀，可直接进入下一步实验，亦可冻入．800C冰箱
保存。
（2）细胞超声
①取固定后细胞，加入：
10．7个细胞+2．5mlTE（PH7．4）buffer+2．5ulinhibitors
（1：
1000）+2．5ulPMSF（1mM）+25ulsodiumButyrate（5mM）
②分成lml一个EP管超声，超声条件：
中档功率，25次，每次30秒，间隔1
分钟。
③进入下一步实验，亦可放入．800C冰箱保存
（3）CHIP
①实验组和对照组超声后样本分别：
取200ul加入HDACl抗体；取200ul加入IgG；留200ul做Input（Input目的：
1、优化PCR条件，2、作为阳性对照）。
每个EP管加
40ulDynabeadsProteinA，再加800ulPBS上下颠倒洗1次，EP管放到磁力架上2分
钟，吸去PBS，再加入超声好样本上清200ul，混匀后40C摇晃10分钟。
②14000rpm，4。
C低温离心5分钟，保留上清。
③每个样本1管加IgG抗体2ul，1管加HDACl抗体2ul，4。
C振荡过夜。
④14000rpm，4。
C低温离心5分钟，将上清移入新EP管。
每管加入20ul清洗好
的DynabeadsProteinA，4。
C摇晃孵育1小时。
⑤离心，保留沉淀。
用Dialysisbuffer洗涤沉淀后再次离心，仍然保留沉淀。
@washbuffer洗涤沉淀，离心（条件同上），弃上清。
⑦每个样品分别用100ulEB液洗脱2次，震荡15分钟，离心（条件同上），分别
收集上清。
⑧分别取200ul各个样本个上清，离心（条件同上），将上清收集到另一EP管。
⑨每管上清中加入20ul5MNacl混匀，和Input样品分别65。
C孵育过夜。
（4）DNA提取纯化
①孵育过夜样品和Input样品每EP管，加入3ul10％SDS、20ul蛋白酶K，65。
C孵育8小时。
②每EP管加入200ulPCI，振荡30秒，离心：
65。
C，12000rmp，10分钟。
上清
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移入新管。
③上清加20ulNaAc、lulglycogen、500ul无水乙醇，混匀，放．80。
C冷冻1小时。
④离心30分钟，4。
C，弃上清。
⑤70％乙醇洗一遍，离心10分钟，4。
C
⑥干燥DNA，加入20uTEbuffer溶解沉淀。
（5）RT-PCR比较实验组和对照组DNA①测定DNA浓度：
NanoDrop超微量分光光度计测量DNA浓度值。
②RT-PCR反应体系及后续步骤与第二章相同。
4．1．3统计学分析
本实验采用GraphPadPrism5软件行统计学分析。
所有实验数据均采用双尾Student’t检验，数据表示为平均值士标准偏差（SD）。
通过公式2A（Ctlp-Ctinput）№]计算ChIP实验相对富集量。
P<0．05表示差异有统计学意义。
4．2实验结果
以空载体质粒转染细胞为阴性对照，以HDACl．RNAi质粒转染细胞和HDACl过表达质粒转染细胞为实验组。
ChIP分析发现：
干扰质粒下调子宫平滑肌细胞HDACl基因表达后，HDACl蛋白在PRA启动子区富集量减少（P<0．01），而在PRB启动子区无明显变化（图4）；过表达HDACl基因后，HDACl蛋白在PRA启动子区富集量增多（P<0．01），在PRB启动子区无明显变化（图4）。
提示HDACl通过与PRA启动子区结合调控PRA表达，而对PRB无明显调控作用。
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图4ChIP分析HDACl干扰质粒和过表达质粒转染子宫平滑肌细胞后HDACl蛋白在PRA、PRB启动子区富集量的变化。
HDACl．RNAi，shRNA干扰质粒转染；HDAClplasmid，HDACl
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第三军医大学硕士学位论文过表达质粒转染；control，为空载体质粒转染的阴性对照组。
左侧为PRA启动子区HDACl的变
化情况；右侧为PRB启动子区HDACl的变化情况。
4．3讨论
近来研究妊娠晚期子宫平滑肌组织发现，相比于PRB，PRA启动子区乙酰化水平显著升高【61，且在乳腺癌研究中显示HDACl通过结合在ER启动子区调控ER的表达
【12]，这些研究数据给HDACl调控PR的机制的研究提供了方向。
我们通过CHIP技术检测HDACl蛋白与PRA、PRB基因启动子区的结合情况，探索HDACl调控PRA基因表达的机制。
CHIP技术为固定细胞保持HDACl蛋白质和DNA交联，超声破碎细胞染色质到200．500bp小片段，HDACl抗体识别HDACl蛋白，结合在磁珠上的protein
A识别HDACl抗体Fc段，特异性沉淀HDACl蛋白一DNA复合物，分离蛋白和DNA，
最后行RT-qPCR分析。
研究结果显示：
干扰子宫平滑肌细胞HDACl基因表达，PRA启动子区HDACl富集量相应减少；过表达HDACl基因，HDACl蛋白在PRA启动子区富集量增加；而在PRB启动子区无相应改变（图4）。
CHIP实验结果为HDACl蛋白绑定于PRA基因启动子区调控其表达，而对PRB基因无显著调控作用提供直接证据。
综合研究结果表明，表观遗传修饰酶HDACl，通过结合到PRA基因启动子区调节其表达（图4）；在分娩发动时，HDACl表达发生下调可能使组蛋白乙酰化水平升高，导致染色质结构发生改变，差异性激活PRA基因转录，进一步激活分娩相关基因组群转录，参与产程启动。
然而，引起分娩发动时HDACl下降的原因尚未阐明，HDACl与PRA启动子具体结合位点尚不清楚，仍需进一步研究。
且本研究于体外细胞上进行，
并不能完全模拟体内生理环境，因此体外细胞实验结果并不一定能完全模拟体内状态，
亦不一定能在体内发生。
总之，本研究发现HDACl与临产子宫肌层PRs差异化表达相关，并证实HDACl
结合于PRA基因启动子调控PRA表达。
初步为表观遗传修饰酶HDACl参与分娩启动提供实验数据支持。
目前还没有人HDAC的晶体结构，但有研究者从一种与人HDACl有35．2％氨基酸序列同一性的古菌中得到HDAC晶体类似物（HDLP）【34】，并且以此为基础发现许多HDAC抑制剂（HDACi）。
其中部分HDACl抑制剂已经运用于临床或者临床试验[35,36]。
我们期待随着对HDLP、HDACi深入研究，本研究为早产、过期产等分娩启动相关疾病提供治疗新措施。
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4．4小结
本实验以CHIP技术分析干扰组、过表达组、对照组HDACl在PRA启动子区、PRB启动子区的富集情况，见：
干扰组PRA启动子区HDACl富集量减少，PRB启动子区富集量无变化；过表达组PRA启动子区HDACl富集量增多，PRB启动子区富集量无变化。
提示HDACl通过与PRA启动子区结合调控PRA表达，对PRB无明显调控作用。
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全文总结
1、临产组孕妇子宫肌层孕激素受体亚型A表达升高，孕激素受体A和B比值升高，表明孕激素受体亚型A增加和PRs亚型比值失调是“功能性孕激素撤退”重要机制。
2、临产组伴随着PRA表达的升高，HDACl显著下降，表明HDACl可能参与分
娩发动时PRA的调控。
3、干扰HDACl后原代子宫肌细胞PRA基因表达上调，过表达HDACl后，PRA
表达下调，说明HDACl可以直接或间接调控PRA的表达，而对PRB无调控作用。
4、干扰HDACl基因表达后，HDACl蛋白在PRA启动子区富集量减少，过表达HDACl后，HDACl蛋白在PRA启动子区富集量升高，PRB启动子区无显著变化，表明HDACl蛋白通过绑定于PRA启动子区调控PRA表达，HDACl对PRB基因无相同调控作用。
综上所述，HDACl可以调控PRA基因表达，可能通过表观修饰PRA基因而参与“孕激素功能性撤退”机制。
本实验不仅初步研究了分娩子宫PRs差异化表达的机制，而且为表观遗传学参与启动分娩提供实验数据支持。
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第三军医大学硕士学位论文
参考文献
[1]CsapoA．Progesteroneblock．TheAmericanjoumalofanatomy1956；98：
273．91．
[2]MesianoS，WelshTN．Steroidhormonecontrolofmyometrialcontractilityand
parturition．Seminarsincell＆developmentalbiology2007；18：
321．31．
[3]ZakarT'HertelendyF．Progesteronewithdrawal：
keytoparturition．Americanjournal
ofobstetricsandgynecology2007；196：
289—96．
[4]AvrechOM，GolanA，WeinraubZ，BukovskyI，CaspiE．Mifepristone（RU486）aloneorincombinationwithaprostaglandinanalogueforterminationofearlypregnancy：
areview．Fertilityandsterility1991；56：
385-93．
[5]AllportVC，PieberD，SlaterDM，NewtonR，WhiteJO，BennettPR．Humanlabourisassociatedwithnuclearfactor-kappaBactivitywhichmediatescyclo-oxygenase．2expressionandisinvolvedwiththe’functionalprogesteronewithdrawal’．Molecularhumanreproduction2001；7：
581—6．
[6]ChaisY,SmithR，ZakarT，MitchellC，MadsenGTermmyometriumischaracterizedbyincreasedactivatingepigeneticmodificationsattheprogesteronereceptor—Apromoter．Molecularhumanreproduction2012；18：
401—9．
[7]WilliamsKC，RenthalNE，CondonJC，GerardRD，MendelsonCR．MicroRNA．200aservesakeyroleinthedeclineofprogesteronereceptorfunctionleadingtotermandpretermlabor．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2012；109：
7529．34．
[8]SheehanPM，RiceGE，MosesEK，BrenneckeSP．5Beta·dihydroprogesteroneandsteroid5beta-reductasedecreaseinassociationwithhumanparturitionatterm．Molecularhumanreproduction2005；11：
495—501．
[9]MesianoS．Myometrialprogesteroneresponsivenessandthecontrolofhuman
parturition．JournaloftheSocietyforGynecologicInvestigation2004；11：
193．202．
[10]VegetoE，ShahbazMM，WenDX，GoldmanME，O’MalleyBW,McDonnellDE
HumanprogesteronereceptorAformisacell-andpromoter—specificrepressorofhumanprogesteronereceptorBfunction．Molecularendocrinology（Baltimore，Md）
1993；7：
1244—55．
[11]GiangrandePH，McDonnellDETheAandBisoformsofthehumanprogesterone
37
万方数据
第三军医大学硕士学位论文
receptor：
twofunctionallydifferenttranscriptionfactorsencodedbyasinglegene．Recentprogressinhormoneresearch1999；54：
291-313；discussion一4．
[12】KastnerP，KrustA，Turco
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