现代生物学进展Word文档下载推荐.docx
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后来出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳,减少了扩散和对流等干扰作用。
2.支持介质
最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。
在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。
这些介质适合分离小分子物质,操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶,目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
3.电泳装置
电泳装置主要包括两个部分:
电源和电泳槽。
电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。
凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。
根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类:
(1)常压电泳仪(600V):
用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;
(2)高压电泳仪(3000V):
用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序;
(3)超高压电泳仪(30000-50000V):
用于毛细管电泳。
电泳槽
根据电泳种类不同,对电泳槽的设计也不一样。
电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。
(1)自由界面电泳槽
Tiselius设计的自由界面电泳槽,是一个U形玻璃管,在U形管下部放待分离的蛋白溶液,管臂联接到电极上,在电场的作用下,缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相,得到电泳图谱。
这种电泳槽目前已不使用。
但90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。
(2)管状电泳槽
50年代末商品圆盘电泳槽问世。
圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖,上电泳槽具有若干个孔,可插电泳管。
将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内,凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条,样品经电泳分离,蛋白区带染色后呈圆盘状,因而称圆盘电泳(discelectrophoresis)。
(3)板状电泳槽
板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽,是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间,因而称板状电泳(slabelectrophoresis)。
板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳,便于利用各种鉴定方法,直接比较各样品的区带,保证结果的准确可靠;
还可进行双向电泳。
另外,板胶电泳时产生的热量容易消散,凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。
板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。
垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。
电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm,厚度为1mm~2mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。
制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。
水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。
由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以,电泳过程应在适当的缓冲液中进行,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
附属设备
随着电泳技术的发展,电泳技术的种类逐渐增加,凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善,科学家们研制出各种电泳附属设备,如梯度混合仪、外循环恒温系统、制胶板、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。
4.影响电泳速度的外界因素
待分离生物大分子的性质
待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。
一般来说,分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。
电场强度:
指每厘米的电位降,也称电位梯度。
强度越高,泳动越快。
多用常压(100-500V,2-10V/cm)。
溶液pH:
要求恒定,所以用缓冲液作电极缓液,决定带电颗粒的解离程度;
与pI有关。
溶液的离子强度:
缓液离子强度越高,电动势越小,颗粒泳动速度越慢;
反之,则越快。
最适值在0.02-0.2之间。
电渗现象:
液体在电场中,对一个固定支持物的相对移动。
由于支持介质表面可能会存在一些带电基团,如滤纸表面通常有一些羧基,琼脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。
这些基团电离后会使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子,在电场的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电渗。
在pH值高于3时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。
如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同,则加快电泳速度;
如果相反,则降低电泳速度。
电渗现象是电泳的干扰因素,可选中性支持物克服。
影响因素
支持物:
要求均匀、吸附力小,否则会造成电场强度不均匀,影响区带分离,结果重复性差。
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。
在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。
温度:
要求恒定。
通过控制电压或电流、冷却散热解决。
二、电泳分类
1、按分离原理分为:
区带电泳:
电泳过程中,不同离子成分在均一的缓冲体系中分离成独立的区带,目前应用最广。
移界电泳:
Tiselius建立,在U形管中进行,目前已不用。
等速电泳:
需专用电泳仪,当电泳达平衡后,各区带相随分成清晰的界面,并以等速移动。
等电聚焦:
据不同pI的两性电解质在电场中,自动形成pH梯度,使被分离物按各自pI聚集成很窄的区带,分辨率较高。
2、按有无固定支持物分类
自由电泳,包括:
显微电泳(细胞电泳),显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为;
移界电泳;
柱电泳(在层析柱中进行)自由流动幕电泳;
等速电泳等。
持物电泳,应用最多。
无阻滞支持物,如滤纸、醋酸纤维薄膜、纤维素粉、淀粉、玻璃粉凝胶颗粒等。
高密度凝胶,如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或琼脂糖凝胶。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、基本原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂(TEMED)和催化剂(AP)的作用下聚合、交联成三维网状结构的凝胶,以此胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类。
PAGE的历史
1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。
30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:
即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“LastCheck”。
聚丙烯酰胺凝胶的优点
凝胶透明,有弹性,机械性能好。
化学性能稳定,与被分离物不起化学反应。
对pH制和温度变化较稳定。
几乎无电渗作用,样品重复性好。
样品不易扩散,且用量少,灵敏度可达10-6g。
凝胶孔径可调。
分辨率高,尤其在不连续电泳体系中,即浓缩、分子筛和电荷效应为一体。
应用广泛。
可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量制备,还可测定分子量、pI等。
连续与不连续凝胶电泳
连续凝胶电泳:
电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷及分子筛效应。
不连续凝胶电泳:
电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率都较前者佳,应用较广。
2、不连续凝胶体系
为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系,该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。
浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液pH值,蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响,可被浓缩成一条极为狭窄的条带,因此,当蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带,大大提高了分辨率。
不连续凝胶体系中离子运动
最广泛使用的不连续缓冲系统是由Ornstein和Davis(1964)设计的。
样品和浓缩胶中含Tris-HCl(pH6.8),上下槽缓液为Tris-甘氨酸(pH8.3),分离胶中含Tris-HCl(pH8.8),系统所有组分中都含0.1%SDS。
样品和和浓缩胶中的Cl-形成移动界面的先导界面,甘氨酸组成尾随界面,在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前积聚。
此处pH较高,甘氨酸被离子化后穿过被堆集的蛋白质并紧随Cl-之后,沿分离胶移动。
从移动界面解脱后的蛋白质-SDS复合物形成一电位和pH均匀的区带涌动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小分开。
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在蛋白质样品中加入SDS和巯基乙醇后,蛋白质分子在巯基乙醇的作用下,还原成单链,再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物,他们在水溶液中呈长椭圆棒状,短轴基本一致,但长轴随蛋白质分子量成正比的改变。
因此蛋白质在电场中的移动主要取决于蛋白质分子量的大小,不在受蛋白质原有电荷和形状本身的等电点(带电荷)无关。
由于SDS和巯基乙醇的作用,蛋白质完全变性和解聚,解离成亚基或单个肽链,因此,该方法用于分子量测定时,电泳结果显示的只是亚基或单个肽链的分子量。
利用SDS-PAGE测蛋白分子量
根据已知分子量的蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线,再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。
优点:
仪器设备简单,操作方便、样品用量少,耗时少(仅需1天),分辨率高,重复性好等。
不足处:
对电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如糖蛋白)及一些结构蛋白等测定结果不太可靠。
常用的是连续SDS-PAGE,近几年趋向用不连续SDS-PAGE,其分辨率比连续SDS-PAGE高出1.5-2倍。
SDS-PAGA常用试剂
10%SDS,蛋白变性;
消除颗粒电颗,使其统一带负电。
丙稀酰胺Acr和甲叉双丙稀酰胺Bis(29:
1)。
注意:
Arc和Bis有神经毒性并易于吸附皮肤。
10%过硫酸铵(AP)(聚合的引发剂),提供甲叉双丙稀酰胺和丙稀酰胺聚合时所需的自由基,须现用现配。
四甲基乙二胺(TEMED)是加速剂,通过催化AP形成自由基而加快甲叉双丙稀酰胺和丙稀酰胺聚合的速度。
电极缓冲液:
(内含0.1%SDS,0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓液pH8.3):
称Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加入SDS1g,加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL。
样品溶解液:
50mMTris-HCl(pH6.8);
2%SDS,5%巯基乙醇,10%甘油,0.1%溴酚蓝。
(样品缓冲液中的甘油可使样品溶液的密度变大,避免加样后样品上漂;
2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂,并不再形成新的二硫键,溴酚蓝是指示剂,显示电泳前沿线的位置)。
样品缓冲液中的甘油可使样品溶液的密度变大,避免加样后样品上漂;
2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂,并不再形成新的二硫键,溴酚蓝是指示剂,显示电泳前沿线的位置。
分离胶缓冲液:
1.5MTris-HCl,严格调pH至8.8;
Tris18.15g加水溶解,用6NHCl调pH,定容至100ml。
缩胶缓冲液:
0.5MTris-HCl,严格调pH至6.8;
Tris1.5g加水溶解,用6NHCl调pH,定容至25ml。
低分子量标准蛋白试剂盒(17500~94000),每种蛋白含量40μg,用时加入200μL样品溶解液,经处理后,上样10μL。
染色液:
0.1%CBB-R250,40%甲醇,10%冰乙酸。
染色1小时或过夜。
脱色液:
10%冰乙酸,10%甲醇。
脱色需3-10小时。
凝胶选择
操作步骤
第一步:
倒制胶板
首先选择凝胶的浓度,高浓度凝胶的孔径较小对于小分子量的蛋白质有较高的分辨率,相反低浓度的凝胶对于大分子量的蛋白质有较高的分辨率。
将两玻璃板密封好,将冰箱中贮存液取出,平衡到常温后,按上表比例混合,制备分离胶、浓缩胶(充分混匀),加入聚合剂(10%过硫酸胺)及促聚剂(TEMED)轻搅混匀。
倒入密封好的玻璃板间隙中(如果采用倒胶槽,可将胶液直接倒入倒胶槽)用少量正丁醇或水覆盖液面,以隔绝空气,并产生整齐的上液面(注意:
由于丙稀酰胺是神经毒,在制胶过程中需要戴手套,凝胶聚合后则不再有毒性)。
胶液的聚合大约需要半小时,随后倒掉胶板上沿的液体并加入配置好的浓缩胶溶液,插入梳子,聚合后移去梳子。
2)加样与电泳
将制胶板中的密封胶条除去,装入电泳槽,在正负极水槽中加入电极缓冲液,将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空,装好电泳槽,接好电源,开始电泳。
施加在每块胶板上的电流强度应该在30mA左右。
第二步:
样品处理与加样
待测样品一般需10g以上,太稀应予浓缩,含盐量高应先透析,有沉淀应先离心除去。
将待测样品与4倍体积的样品缓冲液于塑料管中混匀,加热至沸保持4分钟,然后取出置冰水中冷却待用,用不完可冷冻贮存备用。
标准液处理与待测液相同。
加样
一般加样体积为10-15微升(2-10μg蛋白)
样品槽内不能有气泡。
用移液器尽可能将样品送至底部,缓慢打出。
第三步:
通电电泳
将电泳槽中倒入电极缓液,连接电泳仪与电泳槽。
上槽接负极,下槽接正极。
加样后,连接稳压电源,恒定电压。
开始的电压为8V/cm,当染料前沿进入分离胶后,把电压提到15V/cm,当溴酚蓝前沿接近凝胶下沿,断开电源,停止电泳。
第四步:
染色与脱色
电泳结束后,分离玻璃板,取出凝胶进行染色,可将无色的凝胶直接放入考马斯亮蓝中振荡染色约1h,再转入脱色液中脱色。
脱色过程中需要更换3~4次脱色液(如果在脱色液中加入海绵和泡沫碎片以吸附染液中的考马氏亮蓝,可加快脱色速度并且可不必更换脱色液)。
经染色、脱色后可得到条带清晰的凝胶,在有图象记录和分析的条件下,可用凝胶成像系统对凝胶进行数字化。
成像、储存及定量分析。
结果与讨论
1)制胶与实验结果重复性的关系:
由于每次制胶时试剂量的加入量有误差,可通过采用一次配制多块胶板的方法来提高实验的重复性。
2)样品分子量与凝胶浓度的关系:
目标蛋白质的分子量较大时,应采用浓度较低的凝胶,以获得较高的分辨率;
反之,对分子量较小的蛋白质,应采用浓度较高的凝胶。
3)凝胶聚合时间长短与凝胶质量的关系:
凝胶的聚合应该在30~60min内完成,聚合太快凝胶不均匀,太慢则浪费时间。
聚合的快慢可通过增减TEMED(四甲基乙二胺)的加入量来改变。
4)电泳的快慢与电流之间强弱的关系:
电流强时电泳速度加快,但产热较多影响奋力效果;
电流过低时产热虽少,但对蛋白质泳动不利。
常用的电流强度应该是每块胶板30mA左右。
绘制标准曲线
相对迁移率rf=蛋白样品距加样端的迁移距离(cm)/溴酚蓝区带中心距加样端的距离(cm)
以标准蛋白的相对迁移率为横坐标,标准蛋白的分子量为纵坐标,在半对数坐标纸上得到一条标准曲线。
根据未知蛋白样品的相对迁移率可直接在标准曲线查出分子量。
4、蛋白质染色液
氨基黑10B,酸性染料,其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。
对SDS-PAGE效果不好。
CBBR250,染色灵敏度比氨基黑高5倍,靠范德瓦尔力与蛋白质结合。
尤其适合SDS-PAGE微量蛋白染色。
CBBG250,比R250多两个甲基,灵敏度不如R250,但比氨基黑高5倍。
染色稳定,适合定量。
固绿(FastgreenFG),灵敏度近似氨基黑,但脱色时不易和蛋白质分离,克服了CBB脱色时的缺点。
荧光染料,常用有丹磺酰氯、荧光胺、MDPF、ANS等。
可与蛋白质末端氨基结合,荧光标记。
银染,(AgNO3)较CBB灵敏100倍,染色机理不详。
蛋白染染料
用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。
选择高吸光系数的染料,与生物大分子紧密结合,形成有色不溶的复合物,而支持介质不吸附染料,便于背景的脱色,有利于蛋白质条带的辨别和定量扫描,从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。
可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多,常用的主要有以下几种:
氨基黑类染色:
蛋白质染色最早是用氨基黑类染料,是一类含有磺酸基的酸性染料,它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。
常用的有:
氨基黑10B(aminoblack10B),萘黑12B200(naphthaleneblack12B200),萘酚篮黑6B(naphthol6B),水牛黑(buffaloblack)等。
这类染料对不同的蛋白质着色不同,有蓝色、棕色、黑色,借此可以鉴别不同类型的蛋白质。
这类染料对不同的蛋白质结合量不同,染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。
染色灵敏度较低,现在这类染料已很少应用,被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。
考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue,简称CBB)
在蛋白质染色中,目前考马斯亮蓝染色法最为常用,1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色,它步骤简便、灵敏度较高,可进行定量扫描。
它可分为R和G型两类:
R型为三苯基甲烷(triphenylmethane),每个分子含有两个SO3H基团,本身偏酸性,磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料—蛋白质复合物。
G型为二甲花青亮蓝(xylenecyaninebrilliantblue),是一种甲基取代的三苯基甲烷。
考马考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15-20g),扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。
考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250,其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在,能选择性地和蛋白质形成复合物,染色迅速,着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来,约45分钟后着色最深,本底低,重复性好,适用于定量分析。
荧光染料:
是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记,于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法,但由于荧光标记蛋白质的定量需要特殊的扫描装置,影响了此方法的广泛应用。
研究工作中使用的荧光染料有以下几种:
(1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰,dansylchloride,简称DNS-Cl):
是最早应用的荧光染料,它在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应,使它们获得荧光性质,在280nm和320nm波长的紫外灯下可观察到电泳条带。
(2)荧光胺(fluorescamine,又称fluram):
作用与丹磺酰氯相似。
在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应,产生荧光。
其优点是由于自身及分解产物均不显示荧光,标记的蛋白质是唯一的荧光物质,因此,凝胶没有荧光背景。
(3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮[2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone,简称MDPF]:
其作用与丹磺酰氯和荧光胺相似,其优点是凝胶上MDPF标记蛋白质的荧光可保持数月。
用MDPF标记时,荧光强度在蛋白质浓度1—500ng范围内呈线性关系,标记蛋白做SDS-PAGE分析时,其相对分子质量的对数(log10)与相对迁移率之间呈线性关系。
(4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonicacid,简称ANS):
染料本身无色,但与蛋白质结合后,在紫外光下可显出黄绿色荧光。
电泳后将凝胶置于此染料溶液中,1—3分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。
硝酸银染色:
目前染色机理尚不清楚,可能是将结合在蛋白质上的银离子还原成金属银而显色,研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性,染色灵敏度是考马斯亮蓝R-250的100倍左右,可以检测0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。
银染显色的方法大致可以分化学显色和光显色两类。
(1)化学显色法(chemicaldevelopment):
又分为双胺银染法(diaminesilverstains)和非双胺银染法(non-diaminesilverstains)。
双胺法:
是用碱性的NH4OH形成银—双胺复合物,固定后的凝胶浸泡在此溶液中,通过酸化(通常用柠檬酸)显像,使用较广泛。
非双胺法:
是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中,银离子与蛋白质发生作用,在碱性条件下,用甲醛将银离子还原为金属银而显像,用酸性溶液(柠檬酸或醋酸)终止显色反应,用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。
非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。
特殊蛋白质染色:
(1)糖蛋白染色:
糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的染色来检测。
如与糖链的反应,用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiff’sreagent)染