细胞死活鉴定Word格式.docx
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此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。
活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
②代谢上的差异：
活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。
基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；
而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。
另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。
亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；
死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
1.细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：
一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养的意义:
具有其他生物技术无可比拟的优点培养条件易改变和控制便于单因子分析便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察在生物学的各个领域如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等已被广泛应用。
细胞培养的局限性在脱离机体复杂环境下细胞培养条件与躯体环境有一定距离观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况细胞培养得到的产物少。
2.染色法鉴别细胞死活
细胞死活的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细
【实验步骤】
小鼠脾细胞原代培养
1.取材：
取小白鼠一只，采用断头法处死；
清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3min。
取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。
取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1~2次。
转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2.分离脾细胞：
用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。
用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。
吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/min，离心1~2分钟。
3.培养脾细胞：
超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。
取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
染色法鉴定细胞死活及活细胞计数
1.试剂配制：
用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。
2.细胞生长状态观察：
从培养箱中取出培养物，观察培养液的颜色。
然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。
3.细胞悬液制备：
取0.5mL细胞悬浊液于试管（本实验中，用玻璃离心管代替）中，加1-2滴台盘蓝染液（约0.1ml），混合均匀，染色2min。
4.细胞计数：
滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，细胞悬液依毛细作用扩散到计数区，使悬液自然充满计数板小室（注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加）。
在普通光镜10x物镜下找到中心处的大方格，改用40X物镜，取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量（注意：
当遇到位于大格线上的细胞，一般数上不数下，数左不数右）。
先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。
5.根据染色结果计算活细胞率：
依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：
【实验结果】
1.细胞原代培养形态观察
图2倒置显微镜下细胞原代培养图示（10×
40）
原代培养后的培养液呈粉红色，上清液澄清，未出现异味，也未被污染。
在倒置显微镜下，原代培养的细胞清晰可见，细胞多呈圆形，形状规则，细胞质均匀。
2.细胞计数（自己原代培养1周的细胞）
用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数区域的五个小方格，计数结果如下:
编号（中格）
右上
右下
左上
左下
中
总数/个
15
7
11
12
死细胞数/个
6
10
8
活细胞数/个
3
1
细胞存活率=活细胞数/细胞总数×
100%
=（3+1+1+0+3）/（15+7+11+12+11）×
=14.29%
每毫升液体中细胞的数=[（15+7+11+12+11）/5]×
25×
104
=2.8×
106个/m
【实验结果分析】
本次实验中所测活细胞率为14.29%，比例略微偏低，分析可能有以下原因可能影响实验结果：
a）在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡；
b）在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会影响观察，导致实验失败；
c）取液时没有摇匀细胞液，导致所吸取的细胞悬液中细胞密度较低；
d）染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这是导致活细胞比例比较低的重要原因；
e）实验中的一些不正确或不规范的操作、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。
【注意事项】
1.小鼠解剖前，一定要在酒精中充分浸泡3min防止杂菌污染无菌操作台；
2.分离脾脏时，不要破坏脾脏，注意保持其完整性；
3.注入缓冲液要慢而准，且适量，不要撑破脾脏，从头部逐渐向尾部后退，保证细胞分散游离出来，也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；
4.时刻注意操作的规范性，避免被杂菌污染，为近一步保证无菌操作台的无菌环境可在玻璃挡板口点燃一个酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；
；
5.培养前，注意在皿盖上做好标记，切记不要写在皿底，以免影响在倒置显微镜下，细胞形态的观察；
原代培养的细胞形态观察
6.培养液PH为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞的生长状况；
7.倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察；
8.生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空
泡证明细胞衰老。
除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。
游离期细胞一般圆形、折光率高、而衰退期细胞皱缩、透明度下降、立体感很差、较易区分；
细胞计数及活细胞率的计算
9.当遇到位于大格线上的细胞，一般取上不取下，取左不取右。
【思考题】
1.为什么要学习细胞生死状态鉴别的方法？
试说明其实际应用意义。
答：
在细胞培养的实验室操作以及制造生物制剂时，有时需要确定某舟细胞的生存状态，以便进行下一步操作，因此选择恰当的细胞生死状态鉴别的方法是十分重要的。
2.各种细胞生死状态方法的原理和判定特征是什么？
原理主要是基于细胞膜的选择透过性和代谢上的差异。
鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
化学染色法：
活细胞的细胞膜是一层选择透过性膜，只允许物质选择性地通过，而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
因此一些化学染料能使死亡细胞着色，而活细胞不着色。
荧光染色法：
活细胞中新陈代谢作用强，一些酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸入，活细胞的酶有较强的活性，将其分解成能发荧光的荧光素该物质不能自由透过细胞膜，积累在细胞内，显微镜下显示有明显的荧光；
而死细胞内的新陈代谢停止，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下不发光。
除此之外，鉴别植物细胞的死活还可以采用其质壁分离性质，将植物细胞放入高渗溶液中，观察其是否发生质壁分离。
若发生，则为活细胞；
若不发生，则为死细胞。
3.活细胞、坏死细胞和凋亡细胞的形态特征是什么？
它们的主要区别有哪些？
活细胞的外形较规则，细胞膜的边缘明显，细胞中能够清晰地看到细胞核。
坏死细胞的特点是：
细胞质膜和核被膜破裂，细胞骨架和核纤层解体。
细胞质溢出，影响到周围细胞，发生炎症反应。
细胞凋亡的特点：
细胞质凝缩，细胞萎缩，细胞骨架解体，核纤层分解，核被膜破裂，核DNA分解成片段，出现梯形电泳图。
细胞坏死指的是细胞收到物理、化学因素的损伤，如机械损伤、毒物、微生物、辐射等，引起的细胞死亡。
而凋亡是“细胞的程序性死亡”，是个体发育、存活必需的正常秩序的一部分。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
4.在动物细胞培养操作过程中，应如何加强无菌操作的观念以避免细胞污染？
动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用整个实验过程都要有无菌操作概念，避免细胞被污染。
5.组织块贴壁培养时，为什么要将贴有组织块的培养瓶先翻转过来培养？
翻转培养瓶的时间不宜过长，为什么？
为了使组织块略干燥能牢固粘于瓶壁上。
时间过长，则组织粘得太紧，不方便培养。
6.皮肤组织块培养时，要静置培养并尽量减少晃动培养瓶，为什么？
晃动培养瓶可能会影响细胞的生长，使刚生成的细胞膜破裂。
7.加入培养液后，即可终止胰蛋白酶的消化作用，为什么？
加入培养液后，细胞获得了足够的养分，也就解除了接触抑制的状态，因此胰蛋白酶的消化作用终止。
8.在细胞传代时，将原培养液倒去后用D-Hank’s工作液洗涤细胞2遍，再加胰蛋白酶，为什么？
D-Hank’s是常见的平衡盐溶液之一，它是组织基本用液之一、在细胞传代时，要确保传代细胞的细胞的渗透压与培养液保持一致，因此需要用D-Hank’s工作液洗涤，起到过度作用。
【作业】
1.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法
（1）细胞水平筛选抗肿瘤药物
细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学等学科的发展为药物筛选提供了新的方向。
细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确和大规模筛选等优点。
目前,在细胞水平上对抗肿瘤天然药物的筛选主要是采用选取几种肿瘤细胞系,以培养细胞为实验模型,用结晶紫染色测定法、四甲基噻唑蓝（MTT）法、SRB法等检测天然药物及其提取物或单体的体外抗肿瘤作用。
温斌等在研究腹腔注射灰树花提取成分对小鼠免疫功能的影响时,采用乳酸脱氢酶法、结晶紫染色法、MTT生物活性测定法等对小鼠脾自然杀伤（NK）细胞和腹腔巨噬细胞进行检测,结果表明灰树花乙醇沉淀物（ET2Pre）和RNA提取物显著增高了小鼠脾NK细胞杀伤活性、巨噬细胞吞噬功能及肿瘤坏死因子（TNF）2α、白细胞介素（IL）21的产生水平。
赵春玲等采用结晶紫染色法和MTT比色法测定了白眉蝮蛇去整合素（rAdinbitor）对人肝癌细胞系SMMC27721细胞向纤连蛋白（FN）黏附的影响,以及对已黏附于FN上的SMMC27721细胞的影响。
实验证明，rAdinbitor能够剂量依赖性地抑制SMMC27721细胞在FN上的黏附，促使已黏附的SMMC27721细胞脱落；
并且能够剂量依赖性地抑制SMMC27721细胞的增殖并且诱导其调亡。
（2）端粒酶活性为作用靶点的筛选方法
端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构。
由富含G的DNA重复序列和端粒蛋白组成,起着保护染色体完整性维持细胞复制能力的作用。
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种特殊的逆转录酶,其功能是合成端粒DNA,使端粒出现多个重复序列从而不断延长。
1994年KIM等通过实验发现,肿瘤细胞中端粒酶活性表达呈阳性,而在正常组织中则无端粒酶活性表达或活性很低。
此后亦有实验证明端粒酶与恶性肿瘤密切相关,因此端粒酶已成为当前肿瘤治疗的靶点之一。
孟志强等在对健脾理气方（由鳖甲、白术、山楂、党参、白花舌蛇草、枳壳、八月扎、茯苓等组成）进行研究时发现,该方药物血清对体外培养的人肝癌细胞株SMMC27721端粒酶活性有抑制作用。
LIAN等的研究结果表明中草药合剂（含茯苓、当归、黄芩、甘草等）能减少c2myc、bcl22的表达及降低端粒酶催化亚基hTERT的活性,可抑制AN3CA和MCF7/ADR细胞的端粒酶活性从而导致细胞生存能力的降低。
（3）以DNA拓扑异构酶为靶点筛选天然抗肿瘤药物
DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerases）通过DNA链的切割、转移和再连接来改变DNA的拓扑结构。
DNA拓扑异构酶在细胞代谢过程中起着极其重要的作用,如DNA复制、基因转录、DNA重组和有丝分裂等。
抗癌药物喜树碱（camptothecin）及其衍生物的作用靶点是真核生物DNA拓扑异构酶Ⅰ,吖啶类化合物、鬼臼毒素类化合物、异黄酮类化合物、多柔比星（doxorubicin）等则作用于真核生物DNA拓扑异构酶Ⅱ。
这些药物可通过DNA拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ引起DNA双螺旋的一条或两条链的断裂从而导致肿瘤细胞的死亡。
李运曼等通过DNA解螺旋实验评价紫草素对拓扑异构酶Ⅰ催化活性的抑制作用。
结果显示,紫草素可显著抑制拓扑异构酶Ⅰ的解螺旋活性,并且能够抑制人白血病K562细胞的增殖。
汤涛等通过实验首次揭示了鸦胆子油乳能够特异性地抑制拓扑异构酶Ⅱ的活力,而对拓扑异构酶Ⅰ没有影响,对DNA也没有直接作用。
这些现象揭示拓扑异构酶Ⅱ是鸦胆子油乳细胞内作用靶点之一。
（4）作用微管蛋白的天然抗肿瘤药物的筛选方法
微管（microtubule）是由αβ微管蛋白异二聚体聚合而成的管状聚合物,是真核细胞骨架的重要组成部分。
微管参与许多细胞功能,包括维持细胞形态、细胞内运输、鞭毛和纤毛的运动、染色体运动和细胞分裂等。
无论是促进微管蛋白聚合、稳定已形成的微管类药物,还是以抑制微管蛋白聚合类药物都通过影响肿瘤细胞的有丝分裂过程,使其生长受到抑制。
因此,微管已成为肿瘤的临床治疗的有效靶点。
KLEIN等用紫杉醇和discodermolide（1990年从海绵动物Discodermiadissoluta中分离得到的多羟基内酯化合物）分别作用A549肺癌细胞,结果显示它们均能迅速导致有丝分裂的异常。
进一步的研究发现discodermolide和紫杉醇联合作用具有明显的协同作用。
1999年MOOBERRY等从海绵Cacospongiamycofijiensis，Fasciospongiarimosa和Hyattellasp.中均发现了新型促进微管稳定化合物laulimalide和isolaulimalide。
Laulimalide可以有效促进微管蛋白的聚合,并且与紫杉醇诱导形成的微管蛋白聚合体相似,但促聚合作用低于紫杉醇。
用laulimatide处理A210细胞可导致剂量依赖性细胞微管网的重组和异常纺锤体的形成,并能诱导染色体的卷绕和多核仁的形成。
（5）应用调节细胞信号传导通路筛选方法
近年来,部分抗肿瘤药物的研发已从传统的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内信号传导通路的新型抗肿瘤药物。
正常细胞和肿瘤细胞在多种信号传导通路的关键组分间存在巨大差异，因此靶向这些组分的抗肿瘤药物具有高选择性、高效、低毒的特征。
目前,药物干预肿瘤细胞信号通路主要是通过环腺嘌呤核苷酸2蛋白激酶A通路、酶联受体信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、钙和钙调蛋白通路等几个通路实现。
SAMEL等报道,芥麦（buckwheat）提取物中一种类似于金丝桃蒽酮的物质能够抑制各种蛋白激酶的活性,抑制内皮生长因子和Ins的受体酪氨酸激酶和苏氨酸激酶的活性。
李宝元等在观察中药白龙片对人胃癌MGC8023细胞不同周期时相癌基因c2H2ras、c2myc和抑癌基因Rb、P53、P21表达的影响时，发现PKC2α基因表达抑制与c2H2ras、c2myc的表达抑制相似，表明两者之间存在因果关系。
（6）应用肿瘤新生血管生成抑制的筛选方法
肿瘤的新生血管是实体瘤生长、浸润和转移的一个重要因素,它为肿瘤的生长提供必需的营养和氧气。
在其生成过程中血管内皮生长因子（VEGF）以及酪氨酸激酶受体（VEGFR）具有极其重要的作用。
目前已发现有许多天然药物及其有效成分可以通过多种途径来抑制肿瘤新生血管的生成。
潘子民等发现人参皂苷Rg3经处理后,荷瘤SCD小鼠无腹腔积液形成,腹腔中肿块散播较少。
实验组肿瘤组织中VEGFmRNA的表达量、VEGF蛋白表达量和MVD显著低于对照组,从而认为Rg3通过下调肿瘤组织中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达量来阻滞肿瘤血管的生成,抑制肿瘤的转移。
姜晓玲等通过比较实验发现,10μg·
mL薏苡仁注射液处理后,极少有新生血管生成,血管生长也很快进入衰退期。
因此认为薏苡仁注射液对肿瘤血管生成有显著抑制作用。
（7）天然药物诱导肿瘤细胞调亡的筛选
细胞调亡（apoptosis）是基因调控下的细胞主动死亡,这一过程又称程序化细胞死亡（programmedcelldeath）。
细胞调亡伴随着细胞质浓缩,细胞核崩裂,微粒消失,细胞膜皱缩,染色质浓缩继而解体,DNA裂成180bp的倍增片段,最后形成调亡小体。
细胞增殖、分化和调亡调节系统的失常将导致细胞恶性生长分裂。
研究发现,许多抗肿瘤药物均通过抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞调亡来发挥抗肿瘤作用。
贾彩云等研究表明,蟾酥灵处理过的K562细胞其生长受到明显抑制,形态学呈现出典型的调亡特征性改变,即核染色质凝集、碎裂、延核周边分布,胞膜内陷将变性的细胞内容物包裹成调亡小体,形成DNA电泳的梯状带。
因此蟾酥灵能有效诱导白血病K562细胞调亡。
陈洁等通过实验证明竹红菌甲素（hypocrellinA,HA）能够诱导人黑色素瘤（A23752S2）细胞产生调亡,并诱导细胞周期停滞在S期。
还能使细胞周期蛋白CyclinB1的mRNA表达增加。
（8）天然药物诱导细胞分化的筛选
恶性肿瘤细胞在形态、功能等方面都类似于未分化的胚胎细胞。
诱导分化治疗是指通过药物诱导,使肿瘤细胞向正常细胞转化,同时对正常细胞无杀伤作用，并且很少有骨髓抑制等不良反应。
诱导肿瘤细胞分化及逆转是当前肿瘤分子生物学中一个重要的研究领域。
钱军等在研究榄香烯乳对体外培养人肺癌细胞株超微结构的影响时发现，实验组癌细胞给药后出现表面微绒毛减少，细胞核和细胞质比例下降,核周边光滑，切迹浅，核仁常为单个，常染色质减少，异染色质增多等现象；
而阳性对照组癌细胞除破碎坏死外，仍显示较高的恶性行为。
上述表现提示榄香烯乳在30μg·
mL的浓度下对体外肺癌细胞具有一定的诱导作用。
CHEN等报道茯苓中的多糖片段可使66.6%人淋巴瘤U937细胞和49.4%人早幼粒白血病HL260细胞诱导分化成为成熟的单核细胞和巨噬细胞,使其表现出正常的生理功能并且表达标志性表面抗原CD11b、CD68和CD14,同时又检测到IFN2γ和TNF2α水平升高。
（9）结束语
随着分子生物学和分子肿瘤学的发展,人们对肿瘤细胞恶化过程中许多新靶点有了进一步的了解,并且针对这些靶点研究和开发了许多新的天然抗肿瘤药物。
近年来,许多天然抗肿瘤药物已经开始采用较原来更加理想的药物筛选系统,而且针对作用机制的药物筛选和药物设计在一定程度上得到了发展。
由于肿瘤本身是一种多基因的疾病,目前肿瘤的治疗仍是一个难题，因此尚需要科研工作者不断地努力来发现和设计出更加有效低毒、高选择性的抗肿瘤药物。
2.诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物的筛选方法
目前在基础研究中，凋亡的定量分析主要依靠流式细胞术。
流式细胞术可以检测细胞凋亡在生化代谢及分子水平的表现，同时阐明凋亡细胞与细胞周期的关系，具有快速、特异性强、灵敏度搞的特点。
研究结果表明，有14种化合物具有不同程度的诱导MCF-7细胞凋亡的活性，其中S1、E-10和E-13化合物诱导MCF-7细胞凋亡效果较强。
用终浓度20μmol/L的S1化合物作用MCF-7细胞12h的细胞凋亡比率可达29.7%；
终浓度为20μmol/L的E-10作用72h的细胞凋亡比率为29.3%；
终浓度为20μmol/L的E-13作用72h的细胞凋亡比率为35.1%。
由于细胞凋亡一场在许多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，科学家们希望通过探讨细胞凋亡机制，了解细胞凋亡与肿瘤细胞死亡的关系，在恶性肿瘤治疗中取得新的突破。
以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已成为治疗恶性
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