生物化学实验复习题.docx
《生物化学实验复习题.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验复习题.docx（78页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
生物化学实验复习题
生物化学实验复习题：
1.
2.
试述旋光法测定淀粉含量的实验原理。
在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。
在必定的水解条件下，不同谷
物淀粉的比旋光度是不同的。
其在171～195之间，所以可用旋光法测定粗淀粉的含量。
3.
4.
5.
6.
7.
淀粉含量测定的方法有几种比较各方法特色。
淀粉是由多个葡萄糖缩合而成的多糖，测定淀粉的方法主要有酸水解法、酶水解法和旋
光法等。
1、酸水解法：
面粉经乙醚除掉脂肪，乙醇除掉可溶性糖类后，用酸水解淀粉为葡萄糖，
按复原糖测定方法测定复原糖含量，再折算为淀粉含量。
2、酶水解法：
面粉经除掉脂肪及可溶性糖类后，此中淀粉用淀粉酶水解成双糖，再用
盐酸将双糖水解成单糖，最后按复原糖测定，并折算成淀粉。
3、旋光法：
在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。
在必定的水解条
件下，不同面粉淀粉的比旋光度是不同的。
其淀粉的比旋光度在171~195之间，所以可
用旋光法测定淀粉的含量。
8.
9.
简述旋光法测定淀粉的重点步骤。
1.样品的办理
在电子天平上称取小麦粉置于三角瓶中→加入50ml1%HCl混成浆状（不可以有结块）→
开水浴中正确加热15min→先加1ml30%ZnSO4混匀→再加1ml15%亚铁氰化钾混匀→
移至100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤→弃去最先15ml采集其余滤液。
2.旋光度测定
取滤液20ml置于旋光管中，先用1%HCl调理旋光仪“0”点，而后将样品溶液放入旋
光仪中测α
10.写出计算粗淀粉含量的公式并说明各符号的含义。
11.
12.试述凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理。
13.含氮的有机物与浓硫酸共热时，此中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮
则转变为氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到必定浓度的过度硼酸溶液中，硼酸汲取氨后使溶液中氢离子浓度降低，而后用标准无
机酸滴定，直到恢复溶液中本来氢离子浓度为止，最后依据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。
14.蛋白质含量测定的方法有几种比较各方法特色。
①染料法，该法最近几年在某些方面有取代经典的Lowry法趋向，因为它操作简单，反响时间短，染料-蛋白质颜色稳固，抗扰乱性强。
本法的弊端是：
关于那些与标准蛋白氨
基酸构成有较大差异的蛋白质，有必定偏差，因为不同的蛋白质与染料的联合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸构成邻近的蛋白质。
双缩脲（Biuret）法，此法的长处是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅邻近，以及干
扰物质少。
主要的弊端是敏捷度差。
所以双缩脲法常用于快速，但其实不需要十分精准的
蛋白质测定。
酚试剂法（Lowry）法及紫外汲取法双缩脲法操作简单，线性关系好，但敏捷度差，样品需要量大，丈量范围窄，所以在科研上的应用遇到限制；而酚试剂法填补了它的弊端，因此在科研中被宽泛采纳，可是它的扰乱要素多；
②定氮法,双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外汲取法.考马斯亮蓝法（Bradford法）.
凯氏定氮敏捷度低,合用于氮,偏差为±2％费时
10小时将蛋白氮转变为氨,用酸汲取后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸积淀蛋白质而分别）用于标准蛋白质含量的正确测定；扰乱少；费时太长
双缩脲法（Biuret法）敏捷度低20mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋?
紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定,但不太敏捷；不同蛋白质显色相像
紫外汲取法较为敏捷50～100mg快速10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在
280nm处的光汲取各样嘌吟和嘧啶；
Folin－酚试剂法（Lowry法）敏捷度高5mg慢速40～60分钟双缩脲反响；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe复原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；
各样硫醇耗资时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法（Bradford法）敏捷度最高5mg快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质联合时,其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；
SDS最好的方法；扰乱物质少；颜色稳固；颜色深浅随不同蛋白质变化
15.简述凯式定氮法测定蛋白质的重点步骤。
16.
置于凯氏试管底部→加混淆混淆催化剂和
3ml
1、消化：
在电子天平上称取小麦粉
浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（
2h左右）拿出放入通风橱内至
不冒白
烟，向此中加20ml水，并移至100ml容量瓶定容→即得样品消化液。
同时每4组8人做1空白实验：
混淆催化剂+3ml浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉
加热至淡绿色（1h左右）→冷却后加水移入100ml容量瓶中定容得空白消化液。
2.蒸馏与汲取：
汲取10ml2%的硼酸于三角瓶中→加4d甲基红-溴甲酚绿混淆指示剂
（若变绿色则用LHCl调至紫红色）。
将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下
再汲取5ml消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入10ml40%NaOH
水封（注意：
勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），而后翻开通气阀进行加热蒸馏，直至
，
后
汲取液由紫红色变为绿色，计时蒸馏3min→先移去汲取液再停止加热以防倒吸。
3.滴定：
用LHCl滴定汲取液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积。
17.写出计算蛋白质含量的公式并说明各符号的含义。
18.
19.试述淀粉酶活力测定的实验原理。
20.淀粉酶主要包含α
-淀粉酶和β
-淀粉酶两种。
α
-淀粉酶可作用于淀粉中的α
-1,4-糖
苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等复原糖，β
-淀粉酶可从淀粉的非还
原性尾端进行水解，生成麦芽糖。
淀粉酶催化产生的这些复原糖能使
3,5-二硝基水
杨酸复原，生成棕红色的
3-氨基-5-硝基水杨酸。
21.
淀粉酶活力的大小与产生的复原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的复原糖的量，以单位重量样品在一准时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于萌生后的禾谷类种子中，，此中主假如α-淀粉酶和β-淀粉酶。
两种淀粉酶特征不同，α-淀粉酶不耐酸，在以下快速钝化。
β-淀粉酶不耐热，在70℃15min
钝化。
依据它们的这类特征，采纳加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活
力。
在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去
α-淀粉酶的活力，便可求出β-淀粉酶的活力。
22.淀粉酶活力测定的方法有几种比较各方法特色。
第一种：
同样条件下,分别将等物质的量的酶加入适合条件的淀粉中,而后用碘液测定
第二种：
同样条件下,分别将等物质的量的酶加入适合条件的淀粉中,而后用斐林试剂进行复原糖的测定
23.简述淀粉酶活力测定的重点步骤
淀粉酶活力测定
①α-淀粉酶活力测定
汲取原液1ml于具塞试管中→70℃保温15min用于钝化β-淀粉酶→加1ml1%淀粉置于40℃水浴中保温5min→加1%一二硝基水杨酸2ml开水加热5min后加水至20ml混匀
测A1（用1#管调零）②总酶活力测定
汲取稀释液1ml于具塞试管中→加1ml1%淀粉40℃保留5min→加入1%一二硝基水杨
酸2ml开水加热5min后加水至20ml混匀测A2（用1#管调零）
24.写出计算淀粉酶活力大小的公式并说明各符号的含义。
25.
β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力
麦芽糖含量从标准曲线上查得麦芽糖的毫克数原液体积为100
稀释倍数为50
规定：
40℃5分钟内淀粉酶水解淀粉产生1mg麦芽糖为1个活力单位（u）
26.试述SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的实验原理。
27.聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主假如依据各蛋白质组分的
分子大小和形状以及所带净电荷多少等要素所造成的电泳迁徙率的差异。
在聚丙烯
酰胺凝胶系统中，加入必定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使全部蛋白质颗粒表面覆
盖一层SDS分子，致使蛋白质分子间原有的电荷差异消逝，此时，蛋白质分子的电
泳迁徙率主要取决于它的分子量大小。
当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，
电泳迁徙率与分子量的对数呈直线关系。
28.试比较已做实验测定蛋白质分子量方法的异同点。
①当前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包含粘度法：
该方法操作简单、设施价钱较低，往常不需要标准样品，但没法测定聚合物的分子量散布。
凝胶过滤层析法：
凝胶层析技术操作方便，设施简单，样品用量少，周期短，重复性能好，条件平和，一般不惹起生物活性物质的变化，并且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，当前已获取相当宽泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有必定的限制性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超出5%时，测得分子量比真切的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真切的要小。
凝胶浸透色谱法：
凝胶浸透色谱法分别速度快、剖析时间短、重现性好，进样量少、自动化程度高。
但设施投入较大，价钱较高。
SDS-凝胶电泳法：
实验成本较低，仪器设施也相对很简单，一套电泳装置即可。
可是精准程度相对较低，好的电泳图谱需要必定的技术。
浸透压法，电喷雾离子化质谱技术、基质协助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法
②异；一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，，所以
是亚基（肽。
凝胶层析与分子形状有关，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与分子
形状没关。
同；都能分别不同分子量的蛋白质；原理同样
SDS-PAGE超速离心凝胶过滤粘度法生物质谱技术
29.简述SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的重点步骤。
1.电泳槽的安装：
取两块玻璃板→将带玻璃条的板（高板）搁置桌面上→在上边搁置“U”型橡胶条→最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。
2.凝胶液的制备与灌装：
配置
20ml凝胶液：
在小烧杯中挨次加入
5ml
30%凝胶储液，
10mlPH凝胶缓冲液（用前混匀再取），2ml1%TEMED，重蒸水，
10%过硫酸铵混匀后
→马上沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿→插上梳子置于
35oC培养箱中
搁置15min，待胶凝后取下“U”条→从头将胶板搁置于电泳槽内→向外槽内加三分之
一槽深电极缓冲液→向内槽加入电极缓冲液没过低板→最后拔出梳子。
3.加样：
用微量进样器加入
10μl标准蛋白于中间胶槽内→其余槽内加入
10μl以下样
品①牛血清蛋白②绿豆分别蛋白
4.电泳：
连结电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，翻开电源→调电流120mA
→电泳2h（当指示剂前沿超出二分之一胶长时停止）
5.剥胶：
取下胶板倒去电极缓冲液→丈量指示剂迁徙距离和染色前胶长，而后将胶板置
于水龙头下方冲玻板周围直至胶与玻璃板分别
6.染色与固定：
将胶板放入染色盒内→向此中加入%考马斯亮蓝R250使其淹没置于摇
床上染色留宿
7.脱色：
用10%乙酸溶液脱色至谱带清楚，测定脱色后胶长及各谱带迁徙距离。
30.写出电泳法测定蛋白质分子量的计算公式并说明各符号的含义。
31.
32.试述赖氨酸含量测定的实验原理
33.蛋白质中赖氨酸的含量是谷物质量的主要指标之一。
因为动物及人类不可以合成，须
从食品中得以增补，为此培养高含量赖氨酸的谷物，关于提升营养价值有重要意义。
本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料联合法，测定小麦种子中赖氨酸含量。
谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε－NH3与茚三酮试剂可发生颜色反响，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数量成正有关，而其余氨基酸没有自由氨基，
不可以发生这一反响。
采纳碳原子数量与赖氨酸同样的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。
34.氨基酸含量测定的方法有几种比较各方法特色。
常用的有,半定量法：
纸层析法；定量法：
HPLC柱前衍生化法.
1）称干重法.可用离心法或过滤法测定.长处：
可合用于全部微生物,弊端：
没法差异死菌和活菌.
2）比浊法
.原理：
因为微生物在液体培养时
原生质的增添致使浑浊度的增添
可用分光光
度计测定
.长处：
比较正确
.
3）测含氮量
大部分微生物的含氮量占干重的比率较一致
依据含氮量再乘以即可测得其
粗蛋白的含量
.
4）血球计数板法
.长处：
简易、快速、直观
.弊端：
结果包含死菌和活菌
.
5）液体稀释法.对未知菌样作连续的10倍系列稀释,经培养后,记录每个稀释度出现生长的试管数,而后查MPN表,再依据样品的稀释倍数便可计算此中的活菌含量.长处：
可计
算活菌数,较正确.弊端：
比较繁琐.
6）平板菌落计数法.取必定体积的稀释菌液涂布在适合的固体培养基,经培养后计算原菌液的含菌数.长处,能够获取活菌的信息.弊端：
操作繁琐,需要培养一准时间才能获取,测定结果受多种要素的影响.
35.简述测定赖氨酸的重点步骤。
1.标准曲线的制作（每
2组
4人做
1标准曲线）
2、样品的办理与测定：
在电子天平上称取小麦粉
10mg于具塞试管底部→加
1ml2%
碳
酸钠于
80℃水浴中保温提取
10min→加
2ml
茚三铜试剂
80℃水浴中保温
30min
后冷却至室
温→加
5ml95%乙醇和
5ml
蒸馏水充足混匀后转移至离心管中
3000转/分离心
3min（离心
前一定均衡）→取上清液测
A（以
1号管调零）
36.写出计算赖氨酸的公式并说明各符号的含义。
37.试述甲醛滴定法测定氨基氮的实验原理。
常温下甲醛能快速与氨基酸的氨基联合生成亚羟甲基化合物，使上述均衡右移促进NH3+释
放H+，从而使溶液酸度增添，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值左右），依据滴定终点
时所耗费标准碱的量即可算出反响系统中存在的游离氨基即氨基氮的含量假如样品为一种
已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。
假如样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混淆物，
则只好算出其氨基氮的含量。
38.简述甲醛滴定法测定氨基氮的重点步骤。
已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:
取3只三角瓶编号①2ml1%甘氨酸②2ml1%甘氨酸③2ml水（空白）
均加5ml水和5ml中性甲醛（用前加2滴%酚酞滴加LNaOH调至淡红色），及4滴%酚酞混匀→用L滴至粉红色出现为止→分别记下耗去标准碱的体积）
39.写出甲醛滴定法测定甘氨酸的公式并说明各符号的含义。
40.试述纸上层析法分别氨基酸的实验原理。
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分派层析，滤纸纤维上的－OH拥有亲水性，所以能吸附
一层水作为固定相，而往常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下贱动，称为下行层析；
自下而上流动，称为上行层析。
流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相
之间不停分派而获取分别。
41.氨基酸分其余方法有几种比较各方法特色。
42.氨基酸的分别提纯方法主要有积淀法、离子互换法、萃取法、电渗析等
43.离子互换法，依据氨基酸是两性电解质这一特色,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、
pI值的差异,利用离子互换树脂对各样氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分别纯
化。
离子互换法的分别步骤主要包含树脂的办理、装柱、均衡、加样、洗脱等步骤
44.
当前仍在工业上发挥侧重要的作用。
积淀法，积淀法是历史最悠长的分别纯化方法，
氨基酸工业中常用积淀法有等电点积淀法，特别试剂积淀法和有机溶剂积淀法。
沉
淀法原理是依据某些氨基酸能够与某些有机或许无机化合物联合而形成积淀，能够
利用这类性质向溶液中加入特定的积淀剂，使目标氨基酸积淀，与其余氨基酸分别，
在分别后再将氨基酸与积淀剂分别即可。
45.萃取法，萃取法主要包含反响萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法
等。
此中，反响萃取法是选择适合的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解
离出来的离子发生反响，生成能够溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有
机相，从而分别氨基酸。
溶剂萃取法，因为氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理
萃取时难以高效提取的，所以常用化学发来萃取氨基酸。
反向微胶团萃取的原理相
对复杂，表面活性剂自觉形成的纳米级的一种聚体，它的极性尾在外与非极性的有
机溶剂接触，而极性头则摆列在内形成极性核，极性核溶于水后就形成了特别的“水
池”，当含有氨基酸的水溶液与含反相微胶团的有机溶剂相混淆时，氨基酸以带电离
子状态进入反相微胶团的“水池”内或微胶团球粒的界面分子膜层内而被分别。
液
膜萃取是将第三者液体辗成膜状，利用液膜的选择透过性，从而使目标产物透过半
透膜进行分别，这是一种新式的氨基酸分别法，常用于乳酸液泡膜分别L-苯丙氨酸、
精氨酸等氨基酸。
46.
PH值，使氨基酸
电透析，因为氨基酸拥有不同的等电点，故能够经过控制溶液的
带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸搁置在电场中，会
带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负
极挪动。
电透析主要有毛细电透析等方法，经过这类方法能够高效而精准地分别氨
基酸。
47.简述纸上层析法分别氨基酸的重点步骤。
1、均衡：
将睁开剂（乙醇：
水：
冰乙酸＝50:
10:
1）放入培养皿中置于密闭容器内
使其充满睁开剂（24h左右）
2、点样：
取滤纸1张用铅笔在距下方2cm处划线并将所得线段分红5平分从而获取4个标志点，用微量进样器分别取5μl以下样品①phe②lys③pro④混淆Aa向4个标志点上加样（样品扩散中?
≤1cm）
3、展层：
将滤纸卷成筒状且不可以够重叠，并用棉线扎紧而后垂直放入培养皿中进行展层2h
（当睁开剂沿抵达滤纸长度三分之二时，即可拿出）丈量睁开剂前沿挪动距离（a）
4、显色：
用%茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太多）而后将滤纸置于电炉上方20cm
处加热直至斑点出现为止，丈量各斑点中心到点样点距离（b）
48.影响纸上层析法分别氨基酸的要素有哪些
①温度,层析液,样品的浓度等
②1.物质构造关于
Rf值的影响：
极性物质易溶于极性溶剂
（水）中，非极性物质易溶于
非极性溶剂（有机溶剂）中。
比如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。
所从前者在水
（固定相）中分派许多，所以
Rf值低于后者。
2.溶质与溶剂间的互相作用对
Rf值的
影响：
这类影响是由溶质与溶剂间的互相作用与分派系数的关系所决定的。
3.pH对
Rf值的影响：
这类影响主假如由pH与分派系数的关系所决定的。
弱酸与弱碱的解离度
受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分派时，倾向于
极性强的一相，这样，改变
pH就会同时改变分派系数，从而使
Rf也会相应变化。
在
氨基酸的层析法中，
改变溶剂的pH，使酸性和碱性氨基酸的
Rf值改动较大，而中性氨
基酸的Rf值改动较小。
在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降低，从而使
Rf
值变大，而使碱性氨基酸的
Rf变小。
反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨
酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的
Rf值变大。
4.滤纸对Rf值的
影响：
滤纸自己的
pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸获取不同的
Rf值
及不同的斑点形状。
纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，
质地不均
一的滤纸常使溶剂扩展不一致，跟着纤维的纹理流动杂乱，另一方面纸的含水量不均一，
也不可以获取理想的分别成效。
5.温度对Rf值的影响：
Rf值的重现性与恒温状况的
利害有亲密关系。
温度对Rf值的影响主假如因为溶质在固体相与流动相之间的分派随
温度的变化而不同。
随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，所以有
些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。
敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。
温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以
Rf值也改变。
一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不
超出±℃。
49.试述凝胶层析法测定蛋白质分子量的实验原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主假如依据各蛋白质组分的分子大
小和形状以及所带净电荷多少等要素所造成的电泳迁徙率的差异。
在聚丙烯酰胺凝胶系统
中，加入必定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使全部蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导
致蛋白质分子间原有的电荷差异消逝，此时，蛋白质分子的电泳迁徙率主要取决于它的分子
量大小。
当蛋白质的分子量在1
升级会员 