分子生物学实验技术总汇 (1)PPT文件格式下载.ppt

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,脉冲场（pulsed-field）凝胶电泳,Seepage653,酵母染色体脉冲场凝胶电泳,SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis,Proteingelelectrophoresis,聚丙烯凝胶电泳能否分离核酸？

为什么？

常用蛋白质分子量标准参照物,用双向电泳和质谱分析进行蛋白质组分析,Seepage683,根据荷质比,用胰蛋白酶处理，在每个带正电荷氨基酸后进行切割多肽链（K：

赖氨酸；

R：

精氨酸）,Two-dimensionalgelelectrophoresis,Separateallofthethousandsofpolypeptidespresentatagiventimeinagivencelltype.,Proteomics蛋白质组学,Isoelectricfocusing,SDS-PAGE,Ion-exchangechromatography（离子交换层析）,Separatingsubstancesaccordingtotheircharges根据物质的电荷进行分离例1,DEAE-Sephadex（交联葡聚糖）chromatographywithpositivecharges（正电荷）Phosphocellulose（磷酸纤维素）withnegativecharge（负电荷）,IonexchangechromatographyTwoformsofanenzymeareseparated,Seepage680,MultipleformsofeukaryoticRNApolymerase真核生物的多种RNA聚合酶的分离,Seaurchinembryos（海胆胚胎）DEAE-Sephadexion-exchangechromatographyGreen,proteincontentRed,RNApolymeraseactivity,RNApolymeraseIRNApolymeraseIIRNApolymeraseIII,Gelfiltrationchromatography,Separatingsubstancesaccordingtomolecularsize,Gelfiltrationresinsareporousbeads,Seepage680,Affinitychromatography（亲和层析）,亲和层析是一种吸附层析，免疫亲和层析（immunoaffinitychromatography）是最常见的一种蛋白质亲和层析。

珠子上结合了一种靶蛋白（抗原）的特意抗体。

理想的抗体只与靶蛋白发生特异性结合（而这种结合在一定的条件下又是可逆的）。

其他蛋白质都流出柱子。

所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

添加组氨酸标签,Seepage680,2.2MolecularCloningMethods（分子克隆方法）,GeneCloning（基因克隆）,DNA克隆：

构建重组DNA分子并在细胞中保存和扩增这些分子，叫DNA克隆；

Cloninggenebycloningitsbacterialhost.基因是被他的细菌寄住克隆的。

RecombinantDNAtechnique（重组DNA技术）molecularcloning（分子克隆）geneengineering（基因工程）genecloning（基因克隆）,真核基因被连接到小的细菌或噬菌体DNA和将这些重组分子插入到细菌寄住中，产生大量相同的基因。

第一个试管中得到的重组DNA克隆,常用到的名词,p658,SeeMolecularBiologypage61,ThefirstcloningexperimentinvolvingarecombinantDNAassembledinvitro.这是第一个试管中得到的重组DNA克隆,氨苄青霉素（Ampicillin）.卡那霉素（Kanamycin）.四环素（Tetracycline）.氯霉素（Chloramphenicol）链霉素（Streptomycin）.潮霉素（Hygromycin）,常用的选择标记有：

Cutting切割Linkage连接Replication复制Transfer转移Restrictionendonuclease（RE）限制性内切酶Nuclease核酸酶Ligase连接酶Polymerase聚合酶Phosphataseandkinase磷酸化酶和激酶Methylase甲基化酶,常用到的名词：

Seepage654,2.1.1.限制性内切核酸酶RestrictionEndonuclease（RE,Restrictionenzyme）比喻：

切DNA分子的小刀（DNAmolecularknifetocutDNA）限制性内切核酸酶是一类识别特定的DNA序列并在特定位点切割DNA的核酸水解酶“RestrictionenzymerecognizespecificshortsequencesofDNAandcleavetheduplex（sometimesattargetsite,sometimeselsewhere,dependingontype）”.,Seepage655-656,平头末端,粘性末端,3黏性末端,回文序列,一个EcoRI位点的切割EcoR在两条链的识别位点内切割，从而产生5突出末端。

5黏性末端,计算题,有很多种，每种有自己的识别序列（Nowtherearehundredsofrestrictionenzymes,eachwithitsownspecificrecognition）sequence.,返回,概念,平头末端（bluntend）：

断裂位置位于对称轴的中心；

黏性末端（stickyend）：

一些末端或与用同一种酶切割的其他DNA分子之间能通过碱基配对互补而退火，通常称为黏性末端。

5黏性末端：

即5单链延伸末端；

3黏性末端：

即3单链延伸末端；

回文结构或回文序列（Palindrome：

sequenceswithtwofoldsymmetry），是指在一个假想轴的两侧所存在的对称重复序列，即两条链的碱基顺着同一极性读（53或35），均有一样的碱基排列。

HindIIrecognizesthissequence:

GTPyPuACPu:

purine（AorG）CAPuPyTGPy:

pyrimidines（TorC）4bpsequence44=256bases6bpsequence:

morecommon46=4096bases8bpsequence48=65000bases（NotI）,Isocaudamer同尾酶，产生相同的粘性末端BamHIGGATCCBalIIAGATCTIsoschizomer同裂酶，识别相同的DNA序列XmaICCCGGGSmaICCCGGG,ExamplesAblewasIereIsawElba（Napoleonslament）Straw?

No,toostupidafad;

Iputsootonwarts,（awartremedy）Gohangasalami!

Imalasagnahog.（astatementofpreferenceinItalianfood）,回文结构：

Palindrome（sequenceswithtwofoldsymmetry）,EcoRI,PstI,回文序列的例子：

bluntend平头末端stickyend粘性末端,计算题,从下面的一段DNA上有下图示中显示的三种限制酶位点，根据限制图谱中分析：

a.Hpa切割后可获得的片段数目和大小；

b.EcoRI切割后可获得片段数目和大小；

c.这个片段总碱基数是多少？

分子量为多少Da？

长度为多少nm?

Hpa,EcoRI,EcoRI,BamHI,BamHI,0.4kb,1.2kb,0.5kb,0.9kb,ApieceofDNA（aplasmidoraphageDNA）thatservesasacarrieringenecloningexperiments.Vectorsfallintotwomajorclasses:

2.1.2.Vector载体,Plasmidsphages.,载体DNA通常具备3个特性（p658）：

1.含有一个复制起点，能独立于宿主染色体进行自主复制；

2.含有选择标记；

3.含有一个或多个限制酶的单个酶切位点；

PlasmidsasVectors,TheplasmidpBR322,Plasmid（质粒）:

一个宿主染色体以外的、独立的、小的环状DNA，并在寄主体内具有复制能力。

Asmall,circularDNAsthatareindependentofthehostchromosomeandarecapableofreplicatinginhostcell.,a）分子量小，3-10kb,是一个松弛型控制的复制子；

;

b）Containingonlyonecuttingsiteforeachofrestrictionenzymes.只有一个限制性核酸内切梅；

c）Easytobedetected（易发现）.,Representativeexample1（代表性的例子1）（代表性的例子2）pBRplasmidseries（pBR系列）pBR322containsgenesthatconferresistancetotwoantibiotics,ampicillinandtetracycline.Betweenthesetwogenesliestheoriginofreplication.Theplasmidwasengineeredtocontainonlyonecuttingsiteforeachofseveralcommonrestrictionenzymes,includingEcoRI,BamHI,PstI,HindIII,andSalI.,AnIdealplasmids一个理想的质粒,克隆外部DNA使用含有PstI位点的fpBR322克隆（4363bp）（foreignDNAusingthePstIsiteofpBR322）,AMixtureisproduced（一个混合产物）:

Plasmid（质粒）ForeignDNA（外部DNA）RecombinantDNA（重组DNA）E.coli,TherecombinantplasmidnolongerconfersampicillinresistancebecausetheforeignDNAinterruptsthatresistancegene.,怎样才能知道重组成功呢？

ScreeningbacteriawithrecombinantDNAbyreplicaplating,Howdoesonedothescreening?

CellsthatreceivednoDNA,orthatreceivedinsertDNAonly,willnotbetetracycline-resistantandwillfailtogrow.,CellsthathavereceivedrecombinantDNAsdonotgrowontheampicillinplate.,影印接种法,pUCplasmidseries:

pUC18,pUC19ampicillinresistancegene:

forselectingbacteriathathavereceivedacopyofthevector.multiplecloningsites（MCS）多克隆位点（多接头）,lyingwithinaDNAsequenceoflacZpartialgalactosidasegene，whichprovideamoreconvenientwayofscreeningforcloneswithrecombinantDNAs.（半乳糖苷酶的蓝/白斑筛选系统）,Representativeexample2,ThehostbacteriausedwiththepUCvectorscarryotherpartialgalactosidasegene.Inshort,thetwopartialgeneproductscancooperatetoformanactiveenzyme.,galactosidasecancleavesaindicatorX-gal,colorlessgalactoside,whichreleasesgalactoseplusanindigodyethatstainsthebacterialcolonyblue.,Onestepscreeningprocess:

Cloneswithinserts:

whitewhiteinthepresenceofX-galandgrowsonampicillinCloneswithoutinserts:

blue,DirectionalcloningInsertionofforeignDNAintotwodifferentrestrictionsitesofavector,suchthattheorientationoftheinsertcanbepredetermined.twodifferentrestrictionenzymes（EcoRIandBamHI）,半乳糖苷酶的蓝/白斑筛选系统,Phageisatemperatephage.Itcanfollowtwopathsofreproduction.噬菌体是一种温和型的噬菌体，它可以通过两条途径进行生长。

Lyticmode裂解生长Lysogenicmode溶原生长一个包含噬菌体DNA的细菌叫溶源菌（lysogen），这个插入的噬菌体DNA叫前噬菌体（prophage）.,PhagesasVectors作为载体的噬菌体,Phagevectors,Advantage:

Infectcellsmoreefficiently（侵染细胞的效率更高）；

AccommodatemuchmoreforeignDNA（12-20kb）（highcapacity：

高容量）；

useforconstructinggenomiclibraries.（利用它可构建基因主文库）。

Figure8.18Geneticmapofphage.（a）Themapisshowninlinearform.AstheDNAexistsinthephageparticles;

thecohesiveends（cos）areattheendsofthemap.Thegenesaregroupedprimarilyaccordingtofunction.（b）Themapisshownincircularform,asitexistsinthehostcellduringalyticinfectionafterannealingofthecohesiveends.,Phage（48,513bp）,“sticky”ends（粘性末端）,TheregioninthemiddleofthephageDNAwastakenout,butthegenesneededforphagereplicationwasretained.ThemissingphagegenescouldthenbereplacedwithforeignDNA.,insertionvectors插入型载体replacementvectors取代型载体:

DNAisremovedandreplacedwithforeignDNA.Examples:

Charonphages（seepage68）gtZAP,Figure4.8CloninginCharon4.,Inserts（插入）:

12-20kbUseforconstructinggenomiclibraries用它来构建基因组文库,IncompletedigestionwithEcoRIwascarriedoutforobtainingabout16-20kbinserts.用EcoRI进行不完全的消化可得到16-20kb插入片段。

Humanlibrary（人类基因组）:

500,000clones,怎样检出呢？

概念,DNA文库是一群重组DNA分子，它们由同一种载体和不同的DNA插入片段组成。

基因组文库用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。

一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体。

Seepage660-662,Alabelednucleicacidprobe一个标记的核酸探针Plaquehybridization滤膜杂交,Seepage69,Seepage661-663,杂交法可以用来鉴定DNA文库中的某一特定克隆,Cosmidsasvectors（作为载体的黏粒）,Phages+plasmids=cosmids（噬菌体+质粒=黏粒）cossites+originofreplication（黏端位点+复制原点）大容量（highcapacity）40-50kb像噬菌体一样侵染细胞（infectingcellsasaphage）像质粒一样复制（replicatingasaplasmid）,Cosmidsbehavebothasplasmidsandasphages.带有黏端位点（cos）的质粒。

黏粒是由人工构建的含有质粒复制子和噬菌体DNA的COS序列的载体。

M13Phagevectors,Advantage:

产生单链DNA，用于DNA测序和点突变（Thevectorproducessingle-strandedrecombinantDNA,whichcanbeusedforDNAsequencingandforsite-directedmutagenesis）.,噬菌体M13的DNA是单链DNA感染E.coli细胞后变成双链（复制型，RF）,Phagemids（噬菌粒）,Thevectorproducessingle-strandedDNAorpureRNAtranscriptscorrespondingtoeitherstrandofainsert.,pBS,噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。

此间隔区含噬菌体DNA合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。

含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生ssDNA并进行包装。

最基本的根癌农杆菌的质粒：

VectorsbasedonTiplasmidofAgrobacteriumtumefaciens酵母人工染色体：

Yeastartificialchromosomes（YACs）（see参考1page816-817）细菌人工染色体：

Bacterialartificialchromosomes（BACs）（see参考1page816-817）PI噬菌体人工染色体：

PIphageartificialchromosomes（PACs）Expressionvectors（表达载体）:

Acloningvectorthatallowsexpressionofaclonedgene（能够表达克隆基因的克隆载体）.Shuttlevector（穿梭载体）