ips细胞的有关实验.docx
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ips细胞的有关实验
燕山大学
课程设计说明书
小鼠胚细胞液诱导小鼠成纤维细胞转化IPS的研究
学院（系）：
环境与化学工程学院
年级专业：
08级生物化工
学号：
080110050051
学生姓名：
周纪
指导教师：
赵红卫
教师职称：
讲师
燕山大学课程设计（论文）任务书
院（系）：
环境与化学工程学基层教学单位：
生物工程系
学号
080110050051
学生姓名
周纪
专业（班级）
08级生物化工
设计题目
小鼠胚细胞液诱导小鼠成纤维细胞转化IPS的研究
设
计
主
要
内
容
1.用小鼠胚胎提取液诱导小鼠成纤维细胞转化为IPS细胞
2.IPS细胞的鉴定
设
计
要
求
1.要有明确设计的目的
2.设计合理的操作方式
3.设计出合理的测定指标
4.设计的内容要与题目基本一致
5.设计总结与分析
工
作
量
1.至少阅读15篇以上的相关科技文献
2.设计文字至少在15000字以上
工
作
计
划
12.28——1.1查阅资料
1.2——1.4整理文献
1.5——1.6提出设计方案
1.7——1.11撰写说明书
1.12——1.13检查内容，准备答辩
1.13——1.14答辩
参
考
资
料
[1]刘辉,黎江等.细胞提取物介导的体细胞重编程[J].细胞生物学杂志，2008,30（5）:
553-557.
[2]张文成,李艳华.IPS细胞的生成--转录因子的决定性作用[J].中国医药生物技术,2009,4（3）:
165-167.
[3]徐兰,刘敏英.细胞胚胎干细胞的培养—饲养层的制备[J].细胞生物学杂志,2009,31
（2）:
291-262.
[4]常灏,郭彤等.体细胞重编程为多能干细胞的研究进展[J].细胞生物学杂志,2008,30（5）:
545-552.
指导教师签字
基层教学单位主任签字
年月日
燕山大学课程设计成绩评定表
设计者姓名:
周纪学号:
080110050051
设计题目:
小鼠胚细胞液诱导小鼠成纤维细胞转化IPS的研究
指导教师成绩评定（满分100分）：
得分
设计内容的切题程度：
满分20分（）
设计内容立题合理性：
满分10分（）
设计内容的规范程度：
满分10分（）
设计书前后内容完整：
满分20分（）
设计说明说排版成绩：
满分20分（）
设计说明书的工作量：
满分10分（）
设计过程平时成绩：
满分10分（）
总分成绩：
指导教师：
年月日
答辩成绩评定：
（满分100分）得分
仪表成绩：
满分20分（）
口语表达：
满分30分（）
幻灯质量：
满分20分（）
设计分析：
满分40分（）
总分
评定人：
年月日
设计撰写成绩
（70%）
答辩成绩
（30%）
合计
教师签字：
年月日
2010-2011秋季学期
生物工程专业课程设计
结题论文
小鼠胚细胞液诱导小鼠成纤维细胞转化IPS的研究
学院（系）：
环境与化学工程学院
年级专业：
08级生物化工
学号：
080110050051
学生姓名：
周纪
指导教师：
赵红卫
教师职称：
讲师
摘要
本设计用SOL处理小鼠成纤维细胞使细胞膜穿孔，再将小鼠胚胎干细胞提取液替代SOL，小鼠与成纤维细胞孵育合适的时间。
这样胚胎提取液中的活性因子就可以通过小孔进入成纤维细胞，从而介导细胞的重编程，进一步获得小鼠的多功能性细胞（IPS细胞）。
本设计的对照组是只用SOL液与成纤维细胞孵育和只用胚胎干细胞提取液与成纤维细胞孵育。
在对IPS细胞进行鉴定的中，首先通过从细胞的形态学进行鉴定。
IPS细胞与ES细胞相类似，具体表现为细胞呈集落样生长、集落致密且边缘整齐、细胞形态较小。
而只有形态学的鉴定远远不够，故通过对细胞的流式细胞学的检测最终确定被诱导的细胞是否具有ES细胞的特性。
流式细胞学的检测是通过流式细胞仪检测ES细胞的分子标志蛋白在目标细胞中是否成阳性来判断目的细胞是否表达ES细胞的分子标志蛋白，从而确定目的细胞是否具有ES细胞的特性。
关键词：
胚细胞提取物；IPS细胞；细胞冲编排
第一部分：
文献综述
第二部分：
实验设计部分
第一部分文献综述
1.诱导性多潜能干细胞（IPS细胞）的发展历程
1.1IPS细胞的研究方法及进展
2006年，Takahashi等通过巧妙的实验设计，从24个候选基因中通过系统排出过程，先删减到10个基因，从这10个基因中观察去除哪个对细胞克隆数影响最大而最终筛选出4个与胚胎干细胞多能性更为密切的基因——Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4，用逆转录病毒将4个基因转入小鼠胚胎成纤维细胞和成体鼠尾成纤维细胞，置于STO字样层细胞共培养。
成功地将原成纤维细胞重编程为具有胚胎干细胞多能性的细胞。
1.2从小鼠到人的突破
2007年年底关于IPS细胞的研究有了从小鼠到人的突破，又掀起了又一次IPS细胞的研究高潮。
日本京都大学Yamanaka研究小组及没过威斯康辛大学Thomson研究小组通过独立研究，同时成功地利用人体表皮细胞制造出了类ES细胞。
这次人体皮肤细胞“直接改造技术”跨越伦理障碍，令在实验室中培育出人造人体器官的梦想更近了一步。
1.3转录因子的优化
四种转录因子又到体细胞转变为多能干细胞的机制还不是很清楚，并且先前的IPS细胞诱导技术带有致癌基因c-Myc而备受关注。
2008年1月Yamanaka小组和Jaenisch小组利用Oct4、Sox2和Klf43种基因将鼠和人成纤维细胞重编程为更安全的iPS细胞，2008年4月Jaenisch小组运用Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和C-EBPα将终末分化的鼠成熟B细胞重编程为iPS细胞。
2008年6月1Schler小组利用Oct4和Klf42种基因将鼠神经干细胞重编程为iPS细胞。
这使转录因子越来越少而且一些容易引起细胞发生癌变的基因也被一些其他的基因所代替，这是细胞基因突变和癌变的概率大大降低。
这使IPS细胞的安全性大大提高。
1.4证实IPS细胞的全能性
尽管目前的IPS细胞在很多方面都与ES细胞相似，但是却都没有通过最严格的多能性检测。
因此很多人对IPS细胞是否具有足够的潜能产生所有机体组织产生质疑。
直至2007年7月我国科学家首次用IPS细胞培养出哺乳动物。
证实了IPS细胞的全能性。
1.5IPS细胞发展的重大事件
2006年8月，Yamanaka小组将24种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞，最终确定少有4种转录因子组合——Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将成纤维细胞重编程为iPS细胞，2007年11～12月，Yamanaka小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞。
2006-08-25Yamanaka小组利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞。
2007-11-30Yamanaka小组利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞。
2007-12-21Thomson小组利用Oct4、Sox2、Nanog和Lin284种基因将人的体细胞重构为iPS细胞2007-12-21Jaenisch小组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗镰状红细胞贫血，这从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定基础。
2008-01-00Yamanaka小组和Jaenisch小组利用Oct4、Sox2和Klf43种基因将鼠和人成纤维细胞重编程为更安全的iPS细胞。
2008-01-10Daley小组运用4种或6种因子组合将多种人体细胞（不同来源或处于不同发育阶段）重编程为iPS细胞。
2008-04-15Jaenisch小组证实鼠iPS细胞来源的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠脑内，可有效缓解其症状和改善其行为,说明iPS对复杂疾病治疗的可能性。
2008-04-18Jaenisch小组运用Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和C-EBP琢将终末分化的鼠成熟B细胞重编程为iPS细胞。
2008-06-05Ding小组利用Oct4和Klf4与G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294（BIX）组合将神经干细胞高效率重编程为iPS细胞。
2008-06-24Hochedlinger小组利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因将鼠胰腺茁细胞重编程为iPS细胞。
2008-06-31Sch觟ler小组利用Oct4和Klf42种基因将鼠神经干细胞重编程为iPS细胞。
2008-07-03Meissner小组证实5忆-azacytidine可有效提高Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种因子将体细胞重编程为iPS细胞的效率。
2008-07-00Melton小组证实组蛋白去乙酰化酶抑制剂valproicacid（VPA）极大提高体细胞重编程为iPS细胞效率。
2008-08-01Yamanaka小组利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因将小鼠成年肝细胞和胃细胞重编程为iPS细胞。
2008-08-07Jaenisch小组证实Wnt3a可有效提高Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种因子将体细胞重编程为iPS细胞的效率。
2008-08-28利用miRNA-302s将人肿瘤细胞重编程为iPS细胞。
2008-08-29由ALS病人体细胞制备的疾病特异的iPS细胞在体外可定向诱导分化为运动神经元。
2008-09-05Daley小组成功建立一系列人疾病特异的人iPS细胞系。
2008-02-07Jaenisch小组和Hochedlinger小组为更好地研究体细胞重编程为iPS细胞的机制建立了药物可诱导的系统，该系统是一种新的、可预测的和重复性好的研究平台。
2008-10-12Melton小组证实Oct4和Sox2与VPA组合运用可将人成纤维细胞重编程为iPS细胞。
2008-10-17Belmonte小组运用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4将人角质形成细胞高效而快速重编程为iPS细胞。
2009-03-06Jaenisch小组将移除外源基因的人iPS细胞成功诱导成多巴胺神经元，该成果为人帕金森氏症的治疗带来福音。
2008-10-21Smith小组证实Oct4和Klf4与PD0325901和CHIR99021组合运用可有效将体细胞重编程为iPS细胞。
2008-11-06Ding小组利用Oct4和Klf4与小分子BIX和BayK8644组合将小鼠成纤维细胞高效率重编程为iPS细胞。
2008-12-04Deng小组建立了猴iPS细胞系，Xiao小组和Ding小组分别建立了大鼠iPS细胞系.猴和大鼠iPS细胞系的建立说明利用iPS细胞技术亦可简便地建立其他物种的胚胎干细胞样细胞系。
2009-01-20Ma小组用从iPS细胞诱导来的内皮前体细胞和内皮细胞成功治疗血友病A，这从理论和实践上为人类单基因。
2009-03-01Nagy小组和Kaji小组采用转座子法取代病毒介导的基因投递方法高效率制备了virus-free鼠iPS细胞，同时获得iPS细胞后，又成功将先前导入的转录因子基因从iPS细胞中移除。
由上面的发展历程可以看出IPS细胞的发展总是离不开Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44和Nanog等诱导因子的。
而且可以看出IPS细胞将来可以用于制备疾病的新模型一研究发病机制，还可以用于药物研发中以鉴定药物治疗的反应。
IPS细胞还可以为组织工程和移植治疗提供取之不尽的免疫兼容细胞，同时使科学家能找到无须毁灭胚胎而得到胚胎干细胞的途径，不再因伦理道德的问题而束缚探索真理的脚步。
总之IPS细胞为病理，毒理，再生医学以及新药物的研究提供了广阔的前景。
2.细胞重编排的机理
由对细胞发展历程的学习可得在IPS细胞的诱导过程中细胞重排以及遗传因子的作用机理是非常重要的。
为此通过对细胞重编排以及遗传因子的作用机理的学习总结出以下内容。
细胞重编排的意思是细胞内的基因表达有一种类型变成另一种类型。
这一技术的实现将能避免异体移植会产生的免疫排斥反应。
下面以卵母细胞为例阐述细胞重编排的机理。
许多移植进卵母细胞生殖泡的哺乳动物体细胞核被直接重编排而表达干细胞标志基因，包括Oct4,Sox2和Nanog。
在卵母细胞内进行的细胞核重编程不会产生新的细胞，但是与卵子相反的是，这一过程的发生既不需要细胞分裂，也不需要蛋白质的合成。
伴随这个重编程的机理包括：
异染色体的开放；分化标记，如DNA甲基化的去除，组蛋白修饰以及组蛋白交换等等。
这些事件发生的基础是：
受精卵拥有能引起上述效应的高浓度特定蛋白。
如果卵子的蛋白能够在几秒或几分钟的时间内被交换到移植进来的体细胞核的话，那么完全重编程就应该总会发生。
细胞分化的两个基本特征影响着我们对细胞核重编程的理解。
一个是每种细胞似乎都表达着一些决定它们分化状态的基因。
这一结论从细胞融合实验中看得尤其明显。
因此，肌肉细胞就会通过自激活高水平的例如MyoD这样的基因去维持自身的状态。
这样，细胞越大，或者越像胚胎干细胞，它就会拥有更多“自我重编程”分子。
因此，卵子在没有添加外源因子的情况下也很容易被重编程。
在所有重编程的实验里，第二个基本特征是当细胞的分化程度变得越高，通过外源基因来重塑表达谱就变得越困难。
分化的细胞状态变得越来越牢固，当细胞开始它们的终末分化道路，并且堵上其它不恰当的分化途径。
了解这个理论是这一领域的一个巨大挑战，并且大量的信息化工作已经在DNA和组蛋白层面上展开了。
一个普遍的假设就是“快速逃逸”策略。
我们提出在非活性基因的调控区DNA和组蛋白的结合会变得越来越紧密。
虽然大多数的蛋白会以几秒钟或几分钟一次的频率解离与之结合的DNA，并且在一些特殊情况还需要更长的时间，一个由多组分组成的蛋白复合物则可能会在DNA上拥有很长的逗留时间。
因此，一个蛋白复合物的所有组分都刚好解离DNA，并且让重编程因子结合上去的几率是非常小的。
在胚胎干细胞里，大多数基因（这些基因在分化的细胞里是具有活性的基因）就会处于一个去浓缩的状态，对大蛋白复合物具有较短的逗留时间。
根据这个假说，无论是通过核移植、细胞融合、iPS还是转分化来实现的重编程发生的几率就依赖于统计学上DNA调控区域的可进入程度、作用时间、转录本的浓度和其它调控因子。
体积大并且拥有大量调节因子的细胞，如卵子和肌肉管，就会像其它通过实验增强转录因子浓度的细胞一样容易被重编程。
3.相关的转录因子
诱导体细胞的重编程至少需要3个或4个关键的转录因子发挥作用。
Yamanaka研究组一直使用他们筛选出的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4,而Yu等则选择了OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28。
随着研究的不断深入,Nakagawa等和Wernig等均报道了在不转染c-Myc,只使用Oct3/4、Sox2、Klf4这3个基因进行整合的情况下,也可成功诱导出iPS细胞,只不过诱导所需要的时间更长,效率更低。
在转录因子的选择上,还有使用Oct3/4、Sox2、n-Myc、Klf4合的报道。
这些组合的诱导时间和效率都略有不同,其作用机制仍不十分清楚。
虽然目前尚没有确定的转录因子组合得到公认,但可以肯定的是Oct3/4和Sox2在诱导细胞发生重编程的过程中发挥了重要作用。
3.1Oct3/4
转录因子Oct3/4（又称Pou5f1）,属于Oct蛋白家族,含有POU结构域,参与多种基因的调节,特异性地表达于EC细胞、早期胚胎和生殖细胞中,是维持细胞自我更新和多能性的关键因子。
体外培养的Oct3/4缺陷型纯合体胚胎,其ICM只能形成胚胎滋养层细胞,而不能形成ES细胞。
抑制Oct3/4的表达,将导致小鼠和人的ES细胞自发地向胚胎滋养层分化。
Oct3/4不仅能够维持ES细胞的多能性,而且还能促进ES细胞的分化。
当小鼠ES细胞中Oct3/4表达量提高50%时,即可导致其自发地向原始内胚层和中胚层分化。
此外,Oct3/4还在心肌的分化过程中起到了重要的作用。
因此,Oct3/4的表达水平是决定小鼠ES细胞命运的重要因素。
3.2sox2
转录因子Sox2（SRY-relatedHMGbox2）是HMG框（high-mobilitygroupbox）家族转录因子的一员,表达于EC细胞,ICM、外胚层和生殖细胞中。
与Oct3/4一样,Sox2对于胚胎发育和阻止ES细胞的分化都是必须的。
不同的是,Sox2在胚外外胚层的多能细胞中也有表达。
Sox2的缺失将使胚胎因外胚层发育缺陷而死于植入的时期。
Sox2缺陷型纯合体的胚泡（blastocyst）,虽然在形态上是正常的,但在体外培养时这些未分化的细胞却不能增殖,且只能产生滋养外胚层和原始内胚层样的细胞。
通过RNA干扰技术使Sox2在小鼠ES细胞表达下调,将促进ES细胞的分化。
3.3c-Myc
转录因子c-Myc、n-Myc、l-Myc都属于HLH蛋白家族,含有亮氨酸拉链及螺旋-环-螺旋结构。
在人类的基因组中,c-Myc有大量的结合位点,它可能通过修饰染色质的结构和调节非编码RNA的表达,参与细胞的生长、分化和增殖等多种功能的调节。
c-Myc是LIF/STAT3和Wnt这两个维持细胞多能性途径的主要下游靶基因。
即使在不含LIF的培养条件下,稳定表达c-Myc的小鼠ES细胞仍能够保持自我更新和形成嵌合体小鼠的能力。
c-Myc本身又是一种原癌基因,因而它的使用会给iPS细胞带来致瘤性的可能,这就限制了其在临床上的应用。
c-Myc的主要作用可能是增强细胞增殖的能力,因此也许可以通过使用非原癌基因或外源的生长因子来代替c-Myc的功能。
3.4Klf4
转录因子Klf4（Krüppel-likefactor4）是Krüppel样家族蛋白的成员之一,具有锌指结构,高表达于小鼠的ES细胞,以及有丝分裂后期的皮肤和胃肠的上皮细胞,在MEFs和NIH3T3细胞也有表达。
与c-Myc一样,在ES细胞中,Klf4也是LIF/STAT3途径的下游基因之一,其作用机制与Sox2相似,作为协同因子参与Oct3/4介导的基因表达调控。
Klf4虽是一个原癌基因,却具有抑制肿瘤的功能。
它可以通过直接抑制p53的表达,从而参与调节一系列与p53相关联的基因表达调控。
在小鼠胚胎的发育过程中,Klf4可以通过抑制p53间接上调Nanog的表达,以维持ES细胞的未分化状态;还可以通过对p53的调节,阻止由Myc诱导的凋亡发生。
Klf4的过表达将导致Oct3/4的持续表达并抑制ES细胞的分化和细胞的增殖,而只要切断其靶基因之一的p21,就可以拯救Klf4所带来的抑制现象。
缺失p21的细胞,Klf4将通过下调p53促进细胞的增殖。
p21也许作为开关决定了Klf4信号转导的结果。
3.5Nanog
2003年,Chambers等和Mitsui等的研究发现,Nanog在维持ES细胞自我更新和多向分化潜能中具有非常重要的作用。
与c-Myc和Klf4不同,同源异型蛋白Nanog（来自TirNaNog,意为长生不老）是不依赖于LIF/STAT3途径而独自维持ES细胞多能性的因子。
在小鼠ES细胞中,Nanog与Klf4和Klf5结合;而在人类的ES细胞中,Klf5与Oct3/4、Sox2和Nanog共同结合。
Klf4可以通过抑制p53的表达而促进细胞的增殖,而p53又是Nanog的一个负向调节因子,因此,Nanog的过表达将不再需要Klf4/p53途径的激活。
而且,在重编程的起始阶段,Nanog还可与Oct3/4和Sox2共同发挥作用,从而替代Klf4的一些功能。
因此可以推测,通过Oct3/4、Sox2和Nanog而激活Klf5足以弥补外源Klf4的缺少。
总之,在人类体细胞的重编程过程中,Nanog可能调节了下游基因Klf4和c-Myc的表达,从而取代Klf4和c-Myc的作用。
3.6Lin28
Lin28是一种RNA结合蛋白,在ES细胞的分化过程中其表达逐渐下调,在人类体细胞的重编程过程中发挥了一定的作用。
然而,RT-PCR显示诱导的iPS细胞中有一些克隆并没有发生LIN28的转录,说明Lin28也许既不是重编程起始所必需的,也不是维持iPS细胞稳定增殖所需要的。
4.细胞提取物介导的细胞重编程的方法
4.1转化法
转分化（transdifferentiation）指将一种分化的细胞类型直接转变为另一种细胞类型。
细胞完成转分化的过程必须满足以下条件:
供体细胞的一系列基因必须打开,而靶细胞的基因关闭。
当转分化过程较慢时,会有一个靶基因在供体基因激活之前关闭的阶段,当供体细胞基因完全激活后转分化的细胞获得新的特征表型。
如果这种转变发生的太快,这两种细胞的基因产物共存于细胞中,导致转分化不彻底,从而产生杂交类型的细胞。
Landsverk等研究发现用JurkatT细胞提取物处理的人类上皮细胞可呈现T细胞的特征:
如IL2座位组蛋白H4超乙酰化;表达T细胞特异性基因如IL2和表面受体;可诱导T细胞特异的信号途径（如IL2的分泌）。
Hakelien等发现,用大鼠的胰岛瘤细胞提取物处理大鼠原代成纤维细胞可诱导胰腺特异性基因Pdx1和胰岛素的表达,并且有些新的表型在培养过程中可持续几个月之久。
利用相似的途径,Gaustad等诱导心肌细胞作为人类脂肪干细胞起作用,以及Qin等将鼠胚胎干细胞分化成肺细胞。
虽然转分化研究已取得一定成果,但仍需要进一步研究提高转分化的效率,且转分化细胞长期的稳定性需要进一步证实。
4.2用两栖动物的生殖细胞因子进行重编程
体细胞核移植（somaticcellnucleartransfer,SCNT）的分化逆转表明卵母细胞具有建立多能表型的所有成分,但哺乳动物卵母细胞来源有限而限制了这个生物资源的利用,因此推动了寻找卵母细胞替代资源的发展。
Tamada等研究发现鼠EC细胞的细胞核和卵母细胞共培养时,nucleoplasmin（指存在Xenopus卵母细胞中的蛋白质）在染色质的去浓缩过程中起重要作Nucleoplasmin诱导的染色质改型包括中心粒DNA的去浓缩;染色质相关的HP1蛋白的减少;组蛋白H3K9三甲基化的丢失;卵细胞特异性基因c-mos、Msy-2和H1foo的重新激活。
未分化的细胞包含引起成熟分化细胞产生多能性所必须的调节因子。
McGann等研究发现,再生蝾螈肢细胞提取物可诱导C2C12起源的鼠肌小管去分化为可进行DNA复制的成肌细胞,移走细胞提取物后,去分化的表型依然存在,这表明细胞重编程事件已经发生。
Hansis等报道Xenopus卵细胞提取物也可诱导类胚胎干细胞克隆的形成和人类上皮细胞及白血球细胞中多能基因的表达,但是重编程的白细胞不表达具有胚胎干细胞特征的细胞表面标记,因此这种条件下的重编程是部分的、不
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