中国10个家驴品种的微卫星遗传分析.docx
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中国10个家驴品种的微卫星遗传分析
分类号：
Q341学校代码：
10712
UDC：
575研究生学号：
SY20041050
密级：
公开级
2007届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文
中国10个家驴品种的微卫星遗传分析
学科专业动物遗传育种与繁殖
研究方向动物生物技术
研究生蒋永青
指导教师郑惠玲副教授
雷初朝副教授
完成时间2007年6月
中国陕西杨凌
Classificationcode:
Q341Universitycode:
10712
UDC:
575Postgraduatenumber:
SY20041050
Confidentialitylevel:
Public
ThesisforMastersDegree
NorthwestA＆FUniversityin2007
GENETICDIVERSITYINTEN
CHINESEDOMESTICDONKEYBREEDS
BASEDONMICROSATELLITEANALYSIS
Major:
AnimalGeneticsandBreeding
Researchfield:
Animalbiologicaltechnology
NameofPostgraduate:
Jiangyongqing
Adviser:
AssociatedProfessor
Dr.ZhengHui-ling&Dr.LeiChu-zhao
Dateofsubmission:
June,2007
YanglingShaanxiChina
研究生学位论文的独创性声明
本人声明：
所呈交的学历硕士学位论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果是按学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》获得的,如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：
时间：
年月日
导师指导研究生学位论文的承诺
本人承诺：
我的学历硕士研究生贾善刚所呈交的学历硕士学位论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。
如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我必须接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。
导师签名：
时间：
年月日
关于其他单位与人员对研究生学位论文使用授权的说明
任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人未经本论文作者的导师授权，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》有关规定处理并追究法律责任。
经本论文作者的导师同意，授权西北农林科技大学可向主管上级有关单位送交论文的纸质件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用复印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；否则，按违背《中华人民共和国著作权法》有关规定处理并追究法律责任。
研究生签名：
时间：
年 月 日
导师签名：
时间：
年 月 日
硕士学位研究生学位论文
中国10个家驴品种的微卫星遗传分析
作者：
蒋永青
论文评阅人：
答辩委员会主席：
提交论文日期：
2007年6月
论文答辩日期：
2007年6月
学位授予日期：
2007年6月
本研究由
农业部农牧渔业种质资源保护利用项目中国地方牛品种遗传距离测定资助（农财发[2002]9号）
国家自然科学基金（30471238）
资助完成
ThisthesiswasSupportedby
ProjectofMeasurementofGeneticDistancesamongChineseIndigenousBovineBreeds（AgricultureFinanceDepartment[2002]No.9）,
NationalScienceFundationofChina（No.30471238）
中国10个家驴品种的微卫星遗传分析
硕士研究生：
蒋永青导师：
郑惠玲副教授雷初朝副教授
（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌，712100）
摘要
本研究以关中驴、德州驴、佳米驴、固原驴、滚沙驴、泌阳驴、庆阳驴、太行驴、新疆驴和蒙古驴10个家驴品种共415份样品为研究对象，利用10个微卫星标记分析了品种内和品种间的遗传多态性。
计算了多态信息含量、期望杂合度和有效等位基因数，得到了由Nei氏遗传距离和标准遗传距离为基础的NJ聚类图。
结果表明：
1.10对微卫星引物中，HTG7，HTG10，AHT4，HTG6，HMS6，HMS3共6个位点具有高度多态性（PIC>0.5），HMS7位点具有中度多态性，其余3个微卫星座位（HMS1,HTG4和HMS5）为单态，没有多态性。
但是，HMS5位点在蒙古驴、泌阳驴中有个别个体出现多态，可能为突变导致。
2.7个多态位点在10个驴种的平均PIC、H、E分别为0.7642、0.8072、5.9911。
说明中国家驴在这7个位点多态性丰富，杂合度高，可作为有效的遗传标记用于驴品种之间遗传多样性和系统发生关系分析。
3.DA/UPGMA聚类图能比较准确的描述群体间的亲缘关系，各驴种间遗传变异比较大，遗传距离基本与其地理分布相一致。
其中，新疆驴，庆阳驴，固原驴和关中驴这四个品种遗传距离最近，而且聚类关系也非常紧密，说明它们有很近的亲缘关系。
蒙古驴和德州驴这两个大型驴品种聚为一类，说明它们之间的基因交流比较多。
研究结果为加强我国家驴品种种质特性研究及保护利用提供了科学的依据。
关键词：
家驴，微卫星标记，遗传多态性，聚类图
GENETICDIVERSITYINTEN
CHINESEDOMESTICDONKEYBREEDS
BASEDONMICROSATELLITEANALYSIS
Graduate:
JiangYong-qingSupervisor:
AssociatedProfessorDr.ZhengHui-ling&Dr.LeiChu-zhao
（CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity）
ABSTRACT
Byusing10microsatellitemarkers,GeneticdiversityintenChinesedomesticdonkeybreeds（Guanzhong,Dezhou,Jiami,Guyuan,Gunsha,Biyang,Qingyang,Taihang,XinjiangandMenggu）wasestimated;Thepolymorphisminformationcontent,expectedheterozygosityandEffectivenumberofalleleswerecounted,andtheNeighbor-JoiningtreebasedonNei’sstandardgeneticdistancewasgetted.Theresultsshowedthat:
1.Sixoftenmicrosatelliteloci（HTG7,HTG10,AHT4,HTG6,HMS6,HMS3）werehighlypolymorphic（PIC>0.5）.TheHMS7locuswasmediumpolymorphic（PIC<0.5）.Thelastthreeloci（HMS1,HTG4,HMS5）weresinglepolymorphic.However,someIndividualofMengguandBiyangdonkeywerehighlypolymorphic,maybeitwasvariationtocausethis.
2ThemeanPIC,H,Eofsevenpolymorphiclociintendonkeybreedswere0.7677,0.7443,7.2425.Itshowedthat:
TheChinesedomesticdonkeybreedswerehighlypolymorphicandtheheterozygosityisrelativelyhigh.Thesevenlociwereeffectivegeneticmarkertoanalysisgeneticdiversityandthedendrogramrelationshipbetweeendifferentdonkeybreeds.
3.Thedendrogramdescribedthegeneticrelationshipsbetweendifferentdonkeybreeds,whichshowedthelargevariationandcorrespondinggeographicdistribution.ThereweretheclosestgeneticdistanceamongXinjing,Qingyang,GuyuanandGuanzhongdonkeybreeds.Additionally,MengguandDezhoudonkeybreedsweresortedintoonecategory,whichprovedmoreintrogression.Theresultscouldbehelpfulforstrengtheningthestudyofourdomesticdonkeybreedscharacteristicsandreservationandutilization.
KEYWORDS:
domesticdonkey,microsatellite,geneticpolymorphic,dendrogram
目录
引言1
第一部分文献综述3
1常用于家畜遗传多样性研究的分子生物学检测技术3
1.1限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）3
1.2随机扩增多态性DNA（RandomAmplifidePolymorphicDNAs，RAPD）3
1.3扩增片断长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphic,AFLP）3
1.4DNA单链构象多态性（single-strandconformationpolymorphic,SSCP）4
1.5双脱氧化指纹法（dideoxyfingerprints,DDF）4
1.6单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphic,SNP）4
1.7小卫星DNA4
1.8线粒体DNA5
2微卫星的定义，发展史、特点及应用5
2.1微卫星的定义5
2.2微卫星形成机制6
2.3微卫星发展史6
2.4微卫星的特点6
2.5微卫星的缺点7
2.6微卫星在动物育种中的应用7
3微卫星分子数据遗传距离及构建系统发生树方法9
3.1Nei氏遗传距离9
3.2聚类分析10
4中国家驴的起源，品种分类及遗传研究进展10
4.1中国家驴的起源10
4.2中国家驴品种11
4.3中国家驴遗传研究进展13
5研究的目的与意义14
第二部分材料与方法15
1试验材料15
1.1试验样本15
1.2试验药品和试剂15
1.3主要仪器15
1.4有关试剂和溶液的配制16
1.5微卫星引物16
2试验方法17
2.1DNA的提取17
2.2PCR反应体系及反应程序17
2.3琼脂糖电泳检测18
2.410%聚丙烯酰胺凝胶电泳18
2.5聚丙烯酰胺凝胶的银染19
2.6微卫星基因型的判定19
2.7统计指标19
2.8聚类分析20
第三部分结果与分析21
1基因组总DNA的检测21
210个微卫星的PCR扩增结果21
310个微卫星聚丙烯酰胺垂直电泳检测结果21
3.1HMS3垂直电泳图片21
3.2HMS6垂直电泳图片22
3.3HTG6垂直电泳图片22
3.4HTG10垂直电泳图片23
3.5HTG7垂直电泳图片23
3.6AHT4垂直电泳图片24
3.7HTG4垂直电泳图片24
3.8HMS1垂直电泳图片25
3.9HMS5垂直电泳图片25
3.10HMS7垂直电泳图片25
410个家驴品种7个微卫星群体内遗传变异26
4.1等位基因频率26
4.2共有等位基因28
4.3实际观察等位基因数与有效等位基因数目28
4.4群体杂合度与多态信息含量29
5群体间的遗传变异30
5.1总群体杂合度、亚群杂合度和遗传分化系数30
5.2遗传距离31
5.3系统的聚类分析结果32
第四部分讨论和结论35
1讨论35
1.1样本问题35
1.2PCR反应条件35
1.3基因型判定36
1.4微卫星位点的群体遗传特性36
1.5四个家驴品种间的亲缘关系和遗传距离37
2结论38
参考文献:
39
作者简介43
致谢44
引言
中国是世界上家畜遗传资源最丰富的国家之一，是名副其实的养驴大国。
1998年的资料显示，我国当年的养驴数量是955.8万头，约占世界养驴总数（4336.5万头）的22%，居第一位[1]。
不可否认，全球畜牧业商品经济的发展，以及现代家畜育种理论和方法的应用，使得家畜生产性能得到前所未有的改进。
但是，在取得辉煌成绩的同时，家畜遗传资源多样性也受到严重的威胁。
19世纪80年代进行的畜禽品种资源普查结果表明中国已有10个地方良种消失，8个濒临灭绝，20个数量正在减少，今天这种情况还在加剧[2]。
据联合国粮食与农业组织（FAO）1993年统计，大约30%的家畜品种资源处于灭亡状态。
这不仅是现有资源丢失的问题，同时也是家畜育种素材的损失，可能对家畜育种带来不可预料的后果。
因此保护这些家畜遗传资源不受到破坏，查清楚它们之间的亲缘关系，已是一项刻不容缓的任务。
由于我国幅员辽阔，自然条件、生态环境、经济条件的差异，经过长期的自然选择和人工选择，形成各具特色的地方家驴品种，如关中驴。
它们是宝贵的遗传资源财富，是进行育种改良很好的素材。
而我国地方品种在分类与命名上还存在诸多问题，如同种异名、同名异种等。
联合国粮农组织（FAO）在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，也将微卫星作为优先推荐的分析工具，并制定了家畜品种遗传距离的全球方案[3]。
目前，国内外众多学者利用微卫星DNA标记对家畜和濒危、稀有物种的遗传多样性现状做了大量的研究和探讨。
谢芳[4]以关中驴、晋南驴、广灵驴、德州驴和华北驴为研究对象，利用微卫星标记分析了品种内和品种间的遗传多样性。
朱文进[5]等对我国8个地方驴种遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析,结果表明，我国地方驴种基因多态性和遗传多样性相对较高，各驴种的分子系统发生关系与其育成史和地理分布基本一致。
Jordana等[6]用微卫星标记分析了西班牙5个濒危驴品种的遗传多态性，表明微卫星标记可以反映驴品种遗传多样性，对制定家驴遗传资源保护计划有重要意义。
本研究选取关中驴、德州驴、佳米驴、固原驴、滚沙驴、泌阳驴、庆阳驴、太行驴、新疆驴和蒙古驴10个家驴品种为研究对象，它们大体上沿黄河流域分布，代表了我国大部分的驴种资源。
然后用筛选得到的10个微卫星位点对这10个品种进行遗传多样性分析，对于开展家驴种质资源的基础研究、查清我国家驴品种的最新动态、制定家驴遗传资源的评估保护与开发将具有重要意义。
第一部分文献综述
1常用于家畜遗传多样性研究的分子生物学检测技术
1.1限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）
RFLP是1980年由美国学者Botstein建立的识别DNA多态性的第一种方法[7]，基木原理是：
用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，通过电泳和Southern印迹转移将酶切后的DNA转移到杂交膜上，选用一定的探针与之杂交，从而显示出与探针含同源序列的酶切片段在长度上的差异性。
RFLP的遗传本质是由单碱基的突变或结构重排插入、移位、倒位等引起的，它符合孟德尔遗传的共显性标记，结果稳定可靠，重复性好[8]。
但是RFLP标记信息含量低、操作过程复杂，而且一般需用放射性同位素来检查，因而使此技术的应用受到了限制。
1.2随机扩增多态性DNA（RandomAmplifidePolymorphicDNAs，RAPD）
RAPD是1990年由Williams和Welsh几乎同时报道的一种分子标记技术[9,10]。
基木原理是：
用人工随机合成的寡核苷酸（一般10bp）为引物，对被测样本DNA进行PCR扩增。
引物在基因组中可能有很多结合位点，但只有在约2000bp内存在反向平行的、与该引物互补的双链DNA分子，才能将合成的新链作为下一次反应的模板，经35～40次循环即可得到大量的DNA扩增片段，电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外线下检测。
RAPD具有操作简单、周期短、标记数目多、无需预知基因组DNA序列、一组引物可用于任何生物基因组的研究等优点。
但它的重复性差，结果不稳定，易受实验条件影响，且为显性的遗传标记，不能区分F2纯合体与杂合体，必须进行F3分析。
1.3扩增片断长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphic,AFLP）
AFLP标记是1992年由Zabeau等发明的一项DNA分子标记技术[11]。
其基本原理是对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。
使用双链人工“接头”与基因组DNA的酶切片断相连接作为扩增反应模板，“接头”与“接头”相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。
引物由三部分组成：
（1）与人工接头互补的核心碱基序列；
（2）限制性内切酶识别序列；（3）引物3’端的选择碱基序列（1～10bp）。
这样就只有那些两端能与选择碱基配对的限制性酶切片断被扩增，再在高分辨率的测序胶上分开这些扩增产物。
该技术的独特之处在于所用的专用引物可在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片断进行PCR扩增。
具体实验过程中，为了使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶的切点数较少，因而AFLP分析中产生的主要是由两个酶共同酶切的片断。
AFLP兼具RFLP和RAPD两种技术的优点，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的灵敏性。
1.4DNA单链构象多态性（single-strandconformationpolymorphic,SSCP）
SSCP是指等长的单链DNA因核苷酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中表现电泳迁移率的差别。
单链DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别就可以显示出来。
在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片断，将扩增产物进行变性处理，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目地片断中是否存在突变。
SSCP结果判断是根据多个样品之间对比，观察条带之间位置变化，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析的目地。
PCR扩增产物变性后，经中性聚丙烯酞胺凝胶电泳，目的DNA中如果有单碱基置换等突变就会形成不同的构象，从而导致迁移率的变化而出现泳动的变位[12]。
SSCP技术具有灵敏度高、操作简便、结果重复性高、应用广泛的特点。
1.5双脱氧化指纹法（dideoxyfingerprints,DDF）
DDF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。
如果目地片断存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突变位置的双脱氧终止片断无野生型系统，对于每一个突变有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。
DDF法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核苷酸生产特异性的单链DNA，使其长度合适的DNA片断显示SSCP改变。
1.6单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphic,SNP）
SNP标记是WangDG等在1998年建立的。
它是由于基因组核苷酸的变异引起的DNA序列的多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等。
SNY是继RFLP和SSR等之后的第二代分子标记。
SNP位点分布广，几乎遍布整个基因组，平均约1000bp就会出现一个SNP标记。
基本原理是将被检测的DNA片段与高密度DNA探针列阵进行杂交，每一探针的序列与原基因相应序列相比，除有原互补序列外，还包括其它二种改变了的碱基序列，列阵完整而有序，杂交结果通过计算机分析，最后显示出SNP；目前SNP的分析方法主要采用DNA芯片技术[13]。
1.7小卫星DNA
小卫星DNA是指一些重复单位在11～60bp，总长度由几百个碱基到几千个碱基组成的串联重复序列，主要存在于近端粒处，但在不同个体间存在有串联数目的差异。
动物基因组DNA分子中的某些小卫星位点为目前所了解到的变异度最大的DNA区域，突变率每代可达2%以上。
该标记呈稳定的孟德尔遗传，具有高度的个体特异性，但它以Southern杂交为基础，试验周期长，标记分布相对集中[14,15]。
1.8线粒体DNA
线粒体DNA是核外的遗传物质,与核DNA相比有很多特点，分子结构简单，以母性遗传方式遗传，核苷酸歧义度大，进化速度快，在种间、种内有丰富的遗传多样性[16]。
动物mtDNA多态性研究已广泛渗透到保护生物学、系统学、分类学等学科。
较早期的mtDNA多态性研究主要集中于限制性片段长度多态性分析（RFLP）。
近年来，随着DNA测序技术的成熟和普及，mtDNA的研究不断深入，应用日趋广泛。
Watanabe等人[17]分析了亚洲和欧洲猪的mtDNA限制性图谱，发现汉普夏、长白、杜洛克和pitmanMoore猪为欧洲型，而日本野猪、台湾地方猪和Ohmini猪及阿根廷微型猪表现为亚洲型。
兰宏等[18]用4种
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