基于膜片钳放大器传递特性的细胞膜电容测量方法道.docx

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基于膜片钳放大器传递特性的细胞膜电容测量方法道

基于膜片钳放大器传递特性的细胞膜电容测量方法道

摘要膜片钳细胞膜电容测量技术是检测细胞分泌活动的重要手段之一。

由于生物膜的电容率近似为常数，细胞膜电容及其变化是细胞膜表面积及其变化量的重要量化指标。

细胞胞吐过程中，囊泡膜与质膜融合将其内容物释放到胞外空间，此时将导致细胞膜表面积增加;而胞吞过程中囊泡膜回收则使细胞膜面积减小。

因此，研究和改进膜电容测量方法和技术对于更加准确地检测细胞膜电容及其变化量，推动对细胞胞吞和胞吐机制的研究具有重要意义。

为了明确研究膜片钳细胞膜电容测量方法的方向，在对基于阻抗分析的膜电容测量方法进行深入分析的基础上，将膜电容测量方法的关键技术概括为映射机制和校正机制。

映射机制是将单一频率下测量的细胞复导纳和钳位电压下的直流电导变换为细胞的三个等效电路参数;校正机制是为了消除膜片钳放大器（PCA）内部个功能模块电路对细胞响应电流产生的影响，从而获得真正的细胞复阻抗。

针对由Gillis提出并被广泛使用的利用软件锁定放大器SLIA进行细胞膜电容测量的方法在校正机制方面的不足进行了扩展改进，提出了基于膜片钳放大器传递特性的细胞膜电容测量方法（Z-H方法），即利用PCA探头反

传递函数Hsys估算细胞等效电路参数的值。

Z-H方法沿用馈电阻复阻抗Zf和通道

SLIA中的sinedc方法进行参数映射，但通过划分校正类别，即硬件校正和幅度/相位校正，提出了全新的膜电容测量的校正方法。

Z-H方法中硬件校正的目的是准确确定PCA中与细胞膜电容测量相关的硬件参数的实际值，是基于PCA传递特性的膜电容测量的预校正环节。

硬件相关参数包括PCA探头反馈电阻的阻值和杂散电容值，PCA输入电容、注入电容和BNC连接器的分布电容等。

这些参数对Z-H方法准确确定膜电容的绝对值起至关重要的作用。

本研究提出频域方法，即f-方法，以精确确定上述各硬件参数。

f-方法利用正弦信号而非传统的方波信号，通过进行幅度/相位测量确定PCA的上述硬件参数。

实验结果表明，对于细胞模型电路的“10M档”的测量误差约为35，而细胞模型电路的“500M档”的测量误差约为2。

同时，由于f-方法能准确确定膜片钳放大器的快电容，为高质量的快电容补偿提供了保证，从而提高了膜电容测量的精度。

I幅度/相位校正的目的与SLIA相同，但实现方法不同。

Z-H方法的幅度/相位校正是通过膜片钳放大器的通道传递函数Hsys来实现的。

Hsys为主通道和刺激通道的传递函数，代表了主通道和刺激通道的综合特性。

由于采用了在放大器内部多个监测点测量频率响应的方法获得Hsys，使得Z-H方法的幅度/相位校正具有独立于探头负载特性的重要特点，也是Z-H方法对SLIA所做的最重要改进之一。

由于Hsys对放大器设置敏感，为了提高效率，方便测量操作，将各种标准设置组合下的Hsys预先获取并以数据库的形式进行保存和管理，以备实验检索之用。

为了解决慢电容补偿电路（C-slow电路）补偿导纳特性不理想以致影响细胞电参数估算精度的问题，提出了“回加转移导纳”的算法。

该算法通过测量多个监测点的频率响应，将C-slow电路的频率响应转换为等效转移导纳，以提高细胞阻抗测量的精度。

同时，“回加转移导纳”算法提高了膜电容测量的上限频率，使膜电容测量的时间分辨率在已有的基础上提高了近一倍。

关键词:

膜片钳放大器，膜电容测量，全细胞记录，正弦加直流方法，相敏检测器，去极化，分泌本研究得到国家自然科学基金（No.30327001）资助。

IIAbstractMembranecapacitanceCm

measurementwhichmeasuresandmonitorsplasmamembranecapacitanceandits

changesofacellisoneofthemostimportantquantitivetechniquesandiswidelyusedin

thestudiesofexocytosisandendocytosis.Itisindispensabletouncoveringthedetailed

mechanismsofexocytosisandthesecretoryfunctionsofcellssuchaseggsneurons

chromaffincellsmastcellsgranulocytesandendocrinecells.Sincebiologicalmembraneshavearatherconstantspecificcapacitanceofaveragedapproximately1μF/cm2thefusionofgranulesisexpectedtoleadtoanincreaseoftheplasmacapacitanceinproportionaltotheincreaseoftheplasmamembraneeara.Cmanditschangesareimportantquantitativeparametersofcellsurfaceareaandchanges.Exocytosisofavesicleincorporatesitsvesicularmembraneintotheplasmamembraneandincreasesthecell-surfacemembranewhereasendocytosisretrievesmembranefromplasmalemmaanddecreasesmembrane.Hencebymeasuringthechangesincapacitanceonecanquantifythesecretionofcell.Thepatch-clampCmmeasurementhasnowbeenwidelyusedinthestudiesofexocytosisandendocytosiselicitedbydifferentstimulusmechanismssuchasflashphotolysisofacagedcompounddepolarizationintroductionofsecondmessengersintothecytoplasmorapplicationofchemicalsecretogogues.Byintensivelystudyingpopularimpedance-basedmethodsforCmmeasurementswegeneralizethatforanysinusoidalexcitationmethodtwoimportantissuesmustbetakenintoconsiderationi.e.themappingmechanismandthecalibrationmechanism.ForsinglesinusoidstimulationthemappingmechanismistomapthecomplexadmittancemeasuredatthesinglefrequencyandthedcconductancetothethreeequivalentcircuitparametersofthecellwhilecalibrationforCmmeasurementsistocorrectthephaseshiftsdelayandattenuationintroducedbythepatch-clampamplifierPCAandvariousfilters.InthisworkwepresentaZf-and-Hsys-basedCmmeasurementmethodZ-Hmethodformembranecapacitancemonitoringduringthewhole-cellpatch-clamprecordingforourself-developedpatch-clampamplifier.UnliketraditionalmethodsformeasuringCmwedevelopedourown’sbasedonmeasurementsofthecompleximpedanceofthefeedbackresistorofthePCAandatransferfunctionHsysofthestimulusandmainpathsintheIIIpatch-clampcircuitry.TheZ-HmethodextendsGillis’workforCmmeasurements.TheZ-Hmethodusesthesinedcmethodasthe

mappingmechanismwhereasitadoptsadifferentmethodforcalibrationincomparisontothecalibrationmethoddescribedbyGillisandusedbyHEKAPulse/PatchMastersoftware.CalibrationsintheZ-Hmethodarecategorizedintotwocategoriesi.e.thehardwarecalibrationandtheattenuation/phasecalibration.ThehardwarecalibrationistoacurratlydetermineactualvaluesofbasiccomponentsofaPCAandcanbeviewedasapre-calibrationfortheZf-and-Hsys-basedCmmeasurements.Hardware-relatedparameterssuchastheresistanceRfandthestraycapacitanceCfofthefeedbackresistortheinputcapacitanceCitheinjectioncapacitanceCjandtheextracapacitancesintroducedbytheBNCconnectorareofsignificanceinthesenseofobtainingabsoluteestimatesofcellparameters.Inordertodeterminetheactualvaluesoftheabove-mentionedparametersweputforwardafrequency-domainmethodorthef-methodforsimplicityforourPCA.Thef-methodmakesuseofsinewavesandamplitude/phasemeasurementsinsteadofthesquare-waveresponsestodeterminetheaboveparameterswithinaPCAandtherebycalibratesthePACforcapacitancemeasurements.Experimentalresultsprovethatthef-methodisexcellentindetermininghardware-relatedparameterswith35erroroftheimpedanceofthe“10Msetting”andabout2erroroftheimpedanceofthe“modelcell”the“500Msetting”ofthemodelcircuitforourPCA.Thef-methodenablesusnotonlyto

picturecomponentsoffastcapacitancesbutalsotoguaranteecompletefastcapacitancecompensationitmaybeapplicableforotherPCAs.Theattenuation/phasecalibrationintheZ-HmethodisfulfilledbyHsys.HsysisobtainedbymeasuringthefrequencyresponsetothestimulusinputatthreepointswithinthePCAandthereforeitleadstoa

chiefinnovationofthenewapproachi.e.themethodisindependentofanyidealizedassumptionsabouttheloadimpedancethatisappliedtotheprobeinput.ThestrategyforHsysmanagementisalsoprovided:

Hsysisgeneratedon“frequencygrids”atdifferentstandardsettingsofthePCAstoredandmanagedbyasimpledatabaseandthenretrievedforcalculationofcellparameterswhichresultsinahighefficiency.ToavoidthenonidealpropertiesoftheslowcapacitancecompensationC-slowIVcircuitrywepresentanalgorithmi.e.the“addedback”YTransalgorithmforobtainingtheequivalenttrans-admittanceoftheC-slowcircuitry.Thealgorithmmeasuresthefrequencyresponseofthecircuitryandthentransformesitintothetrans-admittancYTranswhichisprovedbyexperiemtsonboththemodelcircuitsandINS-1celltoimprovetheaccuracyofimpedancemeasurementswhentheC-slowcircuitryisturnedon.ValidationoftheZ-HmethodwithrelevantphysiologicaldatawasdonebyexperimentsonbothmodelcircuitsandINS-1cellsandcarefulinterpretationanddiscussionoftheobtaineddataareprovided.Keywords:

Patch-clampamplifierMembranecapacitanceCmmeasurementWhole-cellrecordingsinedcmethodPhase-sensitivedetectorPSDDepolarizationSecretionThisworkwassupportedbygrantfromtheNationalScienceFoundationofChinaNo.30327001.V目录摘

要.......................................................................................................................IAbstract...

..............................................................................................................III1绪论1.1课题

背景......................................................................................................................11.2膜电

容测量的细胞等效电路模型..............................................................................21.3细胞

膜电容测量技术概述..........................................................................................41.4本论

文的主要研究内容............................................................................................182测量方

法分析及方案设计2.1影响膜电容测量方法选择的因

素............................................................................192.2总体测量目

标............................................................................................................222.3技术方案分

析和设计................................................................................................232.4本章小

结....................................................................................................................303Cm测量

的硬件参数校正——f-method3.1Z-H膜电容测量方法相关硬件参数背

景.................................................................313.2f-method概

述.............................................................................................................323.3BNC连接

器分布电容的测量....................................................................................333.4探头反馈

电阻Rf实际阻值的确定............................................................................363.5反馈电阻

分布电容Cf和PC3输入电容Ci的测量....................................................393.6注入电

容Cj的测量...................................................................................................453.7硬件参

数校准结果正确性的检验............................................................................473.8讨

论............................................................................................................................503.9本

章小结....................................................................................................................514基于

PCA传递特性的膜电容测量VI4.1Z-H方法的原

理.........................................................................................................534.2Z-H方法幅度

/相位校正HSYS的实现原理.................................................................564.3细胞参数

映射..............................................................................................................584.4本章小

结....................................................................................................................595Z-H方法

的软件设计5.1软件整体架

构............................................................................................................605.2关键技术解决方案......