人外周血线粒体DNA4977bp缺失与电离辐射相关性分析放射医学专业毕业论文pdf.docx

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与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

学雠文储签移S’彭、签字嗍渺年罗月％日

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中文摘要

本研究包括两部分内容：

第一部分外周血线粒体DNA最佳提取方法探讨

目的探讨简便高效提取人外周血线粒体DNA（mtDNA）的方法。

方法分别用线粒体DNA提取试剂盒方法、某文献方法和高盐沉淀法提取外周血mtDNA，对三种方法所提取到的mtDNA分别经紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增目的产物电泳分析。

结果三种方法所提得mtDNA产量有明显差别，经紫外分光光度检测可得，高盐沉淀法所得mtDNA产量最高，为9．5788±0．3852；文献方法次之，为4．3786±0．1495；试剂盒方法产量最低，为0．7408±0．1801。

对所得mtDNA进行琼脂糖凝胶电泳，亦显示高盐沉淀法所得样品条带最亮。

以mtDNA为模板进

行PCR扩增，均可得533bp大小的目的带，但试剂盒法条带较暗。

结论高盐沉淀法提取人外周血细胞中mtDNA的产量高，质量可控，用于PCR扩增所得产物稳定

可靠，与其他提取方法比较有较好的应用价值。

第二部分人外周血线粒体DNA4977bp缺失与电离辐射的剂量．效应关系研究‘

目的通过对电离辐射诱发的人外周血线粒体DNA（mtDNA）4977bp缺失片断的克隆，探讨辐射诱导的mtDNA4977bp缺失与电离辐射的生物剂量．效应关系。

方法选取年龄28岁的1名健康男性，近期无射线接触史，收集外周血20mL，EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝，平均分成10份，2mI_／份，用本所提供的137铯照射源对外周血样品进行离体照射，吸收剂量率为0．79Gy／min，照

射剂量分别为0．2、0．5、1．0、2．0、3．O、4．0、5．0、6．0、8．0、10．0Gy。

另取1位67

岁老年男性外周血2mL作为阳性对照。

血样照射后在37*（2培养箱中放置2h后进行线粒体DNA的提取。

所得mtDNA产物用巢式PCR方法扩增mtDNA4977bp缺失片断，同时扩增mtDNA序列中相对稳定区域的片断作为内参照，代表总mtDNA的量。

通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，并经凝胶图像分析系统获得灰度值，得出mtDNA4977bp缺失片断与代表总mtDNA的片段的灰度比值。

结果l、从外周血样品中萃取的白细胞mtDNA的质量较高。

2、电离辐射诱发的人外周血线粒体DNA（mtDNA）4977bp缺失片断的大小与理论预期值大小基本一致，在未照射的mtDNA中未能扩增出特异的PCR产物。

3用巢式PCR

方法扩增得到的mtDNA4977bp缺失目的片断，通过对琼脂糖凝胶电泳图像和灰度值的比较，得出照射剂量在O．2～3．OGy之间时，坎度比值基本呈增加趋势；而剂量在4．0～10．0Gy之间时，比值变化较大且无规律性。

结论1、通过在mtDNA4977bp

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缺失片断两侧设计引物，用巢式PCR方法扩增得到了电离辐射诱发的跨4977bp缺失的目的DNA片断。

2、初步建立了检测mtDNA4977bp缺失片断的半定量PCR分析方法。

在相对较低剂量（0．2—3．OGy）．照射时，mtDNA的4977bp缺失的量与受照剂量呈一定相关性，当照射剂量大于4Gy时，这种剂量效应关系较不稳定。

表明mtDNA4977bp缺失片断的半定量PCR分析可能在o．2-3Gy照射范围内对辐射生物剂量估算有意义。

关键词电离辐射，巢式PCR，mtDNA4977bp缺失，剂量效应关系，高盐沉淀法

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ENGLlSHABSTRACI’

RESEARCHFORTHEHUML▲NPERRIPHERALBLOOD脚0CHONDRIAI．

DNA4977BPDEL肌ONANDIONIZINGRADL如['ION

Thearticleincludetwopartscontents．

Part1ResearchformethodsforextractionofthemitoehondrialDNAfromhmnanperipheral

blood

ObjectiveToinvestigateasimpleandefficientmethodforextractionofthemitoehondrialDNA（mtDNA）fromhmnanperipheralblood．MethodsThemtDNAfromperipheralbloodwasextractedbythemethodsofmtDNAkit，somedocumentandhighintensitysaltprecipitation．TheacquiredmtDNAwasdetectedbyultravioletspectrophotometry,agargelelectrophoresisandPCRamplification．ResultsThemtDNAoutputofthreemethodshaveobviousdifference．TheresultofultravioletspectrophotometrywasthatthemtDNAoutputofhighintensitysaltprecipitationmethodwas9．5788±0．3852tobethehighest：

thedocumentmethodwas4．3786±0．1495tobeless；themtDNAkitWas0．7408+0．1801tobetheleast．Agargelelectrophoresis

alsodisplayedthathighintensitysaltprecipitationmethodshowsthelighteststrap．ne

threemtDNAoutputastemplatetocarryoutPCRamplification，theaimstrapof533bpallwasobtained，but,thestrapofmtDNAkitmethodWasdim．ConclusionThe

outputofacquiredmtDNAfromhmnanperipheralbloodbyhighintensitysaltprecipitationmethodwashighest．ThequalityofthatwascontrollableandtheproductofPCRamplificationwasstabile．So，thehighintensitysaltprecipitationhavebetter

applicationvaluethanothermethods．

Part2Researchforthedose·effectrelationforthehumanperipheralbloodmitochondrialDNA4977bpdeletionandionizingradiation

0bjectiveCloningofthefragmentofthemitochondrialDNA4977bpdeletioninhumanperipheralbloodinducedbyionizingradiationtodetectthecorrelationforthemitochondrialDNA（mtDNA）4977bpdeletioninducedbyionizingradiationand

radiationbiodosimetry．Methods20mlhumanperipheralbloodsamplesalecollectedfromahealthyyounthfuldonorwhowasnotradiatedresentlyandaredevidedinto10

shares．Eachshareareirradiatedby137Cs7raywhichradiationdoseis0．2，0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0，8．0,10．0Gy．Inaddition，collectinga67ageold—manperipheralblood2mlaspositivecomparison．After2hours，mtDNAisextractedfrom

．3．

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peripheralblood．ThefragmentofmtDNA4977bpdeletionwasamplifiedfrommtDNAinnested-PCRmethods．Atthesametime，fragmentofrelatedstabledomainofmtDNAsequencealsoamplifiedtorepresenttotalmtDNA．Aimed—fragmentseparatedbyagargelelectrophoresisandanalyzedbygelimageanalyticalsystemtogaingrayscalevalueof

themtDNA4977bpdeletionfragmentandreferencefragmentrepresentingtotalmtDNA．Results1、ThemethodofmtDNAextractedfromhumanperipheralbloodishigh

efficiency．2、ThefragmentofmtDNA4977bpdeletioninducedbyionizingradiationhas

thesamesequencesastheexpectedgenefragment．However,thenon—irradiatedsamplewash’tamplifieddifferentialPCRproducts．3、ThefragmentofmtDNA4977bpdeletionWasobtainedbythenested—PCRmethods．Bycomparatingagargelelectrophoresisimageandgrayscalevalue，weobtainedthatgrayscalevalueshowedincreasingtcndencywithradiationdoseincreasein0．2～3．0Gy．Thevaluehadgreatchangeanddefectedregulmionwhenradiationdosewas4．O～10．0Gy．Conclusion1、PrimerWas

designedineachsidesofthemtDNA4977bpdeletionfragmentandthemtDNA4977bpdeletionfragmentthatwasinducedbyionizingradiationWasamplifiedbynested—PCR

methods．2、Thehalf-quantificationPCRmethodwasestablishedtodetectthemtDNA4977bpdeletionfragment．ThemtDNA4977bpdeletionquantityandionizingradiationdoseshowedfavourabledose．effectrelationinlowerradiationdose．The

dose—effectrelationbecameinstabilitywhenradiationdoseexceeded4．0Gy．

Keywords：

thenested—PCR；themtDNA4977bpdeletion；dose—effectrelation；agargelelectrophoresis；highintensitysaltprecipitationmethod

．4．

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．）￡▲．1‘

刖舌

随着科学技术的发展，核技术已广泛应用于国民经济的各个部门，放射源在工业和医学领域已经成为必不可少的工具。

在工业方面，放射源可用作工业探伤和检查焊接的完整性，也可用来探测地下深层的石油和天然气；利用核能发电，辐射育种及辐射加工和灭菌等。

在医学方面，可用于医用诊断和放射治疗各种各样的疾病。

在辐射技术的研究、生产和应用过程中过量照射事故时有发生，核技术可造福于人类，亦可在失去控制或管理不当时给人类带来危害。

如从事核武器、核设施的操作人员及其他有机会接触放射源的工作人员都时刻面临着意外和事故的威胁，导致意外核事故和意外事故的发生，其对人体健康的危害受到高度重视，及时有效地应急救治放射损伤是至关重要的。

要及时有效地救治受放射损伤人员，首先，应该清楚人体在受到电离辐射后发生损伤的分子机制，为采取进一步的医学干预提供实验依据；其次，就要建立快速、准确地方法对受照人员的照射剂量作出有效的估算，以

便采取相应的救治措施。

辐射剂量估算方法包括物理剂量估算和生物剂量估算。

物理剂量估算因现场环境及照射条件复杂，有很大的不确定性，通常不能准确估算受照剂量。

相比之下，生物剂量估算更加客观一些，可在任何照射条件下较为准确的估算受照剂量。

一、本研究的应用价值和理论意义1、线粒体DNA的结构与功能特点

人类线粒体内包含唯一的核外遗传物质mtDNA，mtDNA是一小的裸露的双链环状DNA分子，全部核苷酸序列已被证实为16569bp，其表达产物对维持细胞的生理功能极其重要。

在线粒体DNA，除了一小段D环区域外，其他序列无内含子，因此任何mtDNA的突变都会影响到其基因组内的一个重要功能区域。

与细胞的核DNA相比，线粒体DNA是母系遗传，没有组蛋白和非组蛋白保护，呈裸露状态，易受侵害，又缺乏有效的修复系统，而且为不对称复制，复制频率和次数高，因此mtDNA较核DNA更易受损伤。

mtDNA发生突变的频率为核DNA的10"--20倍，对突变的固定比核DNA快10"-17倍。

人们对线粒体DNA突变的研究远远落后于对核DNA异常的研究。

近年来，随着PCR技术的应用和发展，mtDNA的研究有了突破性的进展。

线粒体是真核细胞的重要细胞器，在细胞的能量代谢和氧自由基生成过程中扮演重要角色。

mtDNA是独立于核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码的功能。

mtDNA的转录和翻译是在核DNA的调控下完成的。

哺乳动物细胞mtDNA仅占整个细胞DNA的0．1％～l％，每个线粒体中约有10个拷贝的线粒体基因。

人

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mtDNA是含有16569bp的双链闭环分子，外侧链是重链，内侧是轻链，两条链均有编码功能。

mtDNA负责编码37个基因，这些基因组排列紧密，其间没有或仅被少数非编码的序列隔开。

由于mtDNh编码的所有基因对线粒体行使功能都是必需的，所以任何改变这些基因表达的突变都有可能造成能量代谢的降低和氧化磷酸化作用中ROS（活性氧基团）的增多。

mtDNA经常受氧自由基（包括超氧负离子ff、HO：

等）的侵袭，有缺失的mtDNh的复制较完整的mtDNA要快得多。

经过一定时间的累积就可能导致线粒体内膜参与能量转换的酶系功能异常。

许多研究表明，mtDNA突变与生物衰老、神经肌肉性疾病、糖尿病以及肿瘤的发生等有着很紧密的关系。

在这些情况下，mtDNA会发生许多不同的缺失（至今已报道有超过150种缺失）。

从而影响

生物体正常功能的行使。

线粒体DNA突变的主要类型有：

（1）点突变包括发生在结构基因区域的错义突变、tRNA和rRNA编码区的突变（影响线粒体蛋白的合成）；

（2）缺失mtDNA丢失一段或几段核苷酸序列。

缺失类型（片段的大小）多种多样，主要发生在结构基因编码区。

但同一个体的缺失类型往往是一致的。

最常见的缺失类型是缺失4977bp的“5kb普通缺失’’（5kbconunomdeletion）；（3）插入重复即mtDNA上插入一段核苷酸片段形成mtDNA基因序列的重复．在mtDNA上插入重复的发生率要比大片段的缺失少见，在个别病例见有8kb或lOkb长度的重复。

mtDNA插入重复的临床表现形式与缺失相似，但其机理尚不清楚，推测可能与表达产生有害基因产物有关。

mtDNA自身的特点决定了它比核DNA对氧化损伤更敏感：

（1）mtDNA是唯一的核外遗传物质并暴露于活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）自由基环境中；

（2）mtDNA与线粒体上的电子传递链紧密相连；（3）mtDNA呈裸露状态，缺少组蛋白和非组蛋白对DNA进行保护作用；（4）mtDNA损伤的修复能力低；（5）线粒体本身含有类似微粒体细胞色素P450氧化酶的催化酶，故可直接在线粒体原位激活一些化学致癌物质；（6）mtDNA与富含脂类的线粒体内膜相连，使得mtDNA对脂溶性化学物质及可引起线粒体膜不稳定的因素非常敏感，并往往成为亲电子物质首选的靶点；（7）mtDNA的复制酶由核DNA编码，即使mtDNA损伤十分严重，但如果其相关的复制酶编码基因无损伤或损伤很小，都不会影响损伤的mtDNA复制。

这引起mtDNA损伤在细胞内累积，使mtDNA的突变率比核DNA高10倍，而且mtDNA易发生点突变和缺失突变。

2、mtDNA在辐射生物学中的应用

一般认为，放射生物学效应是由于电离辐射直接或间接作用于DNA或其它结构（如细胞器的膜）而引起的。

Kubota等人用X射线照射不同放射敏感性的人的鳞状上皮癌细胞系和对放射敏感的毛细血管共济失调症细胞，用PCR定量的方法发现对辐照抵抗的鳞状上皮癌细胞在lOGy齐O量的照射下产生4977bp的缺失，而对放射敏感的鳞状上皮癌细胞在2Gy的剂量，毛细血管共济失调症细胞在1Gy的剂量照射下均产生

这大片段的缺失。

Wardell等人发现，在接受全身放化疗的一些癌症患者的血液标

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本和肌肉活检中有线粒体控制区域的点突变和大片段缺失的水平均显著高于对照组。

间接作用主要是指活性氧（ROS）产生的作用，ROS包括超氧自由基（02一）、过氧化氢（H202）、羟自由基（．OH）和单线态氧。

ROS造成的损伤约占放射损害的2／3。

ROS引起羟基游离基产物羟基脱氧鸟苷的大量贮积，而人类细胞的mtDNA是ROS的主要攻击对象，尤其是羟基游离基，它导致了mtDNA的缺失。

mtDNA和RoS的堆积可以相互促进，形成大量的脂质过氧化物，从而影响线粒体基因组的生物发生并导致细胞核DNA的损伤。

线粒体mtDNA的缺失和变异所产生的结果，可表现为辐射敏感性的变化。

mtDNA受到辐射可发生DNA双链或单链的断裂，这和细胞核DNA受到辐射时的表现是一样的。

但两者的修复程度不同。

May等发现。

以辐射诱发的线粒体mtDNA和细胞核DNA断裂，在2h内，细胞核DNA损伤大部分被修复，而线粒体mtDNA的损伤只有25％被修复。

电离辐射一方面可以通过活性氧的产生而导致线粒体DNA基因的丢失、错义或缺失突变，引起基因表达异常或不表达，使线粒体膜上或膜内蛋白质异常或缺乏，不能行使正常的生理功能，从而影响细胞的凋亡，甚至死亡。

另一方面也可通过激活凋亡相关基因诱导细胞凋亡，即：

核凋亡相关鉴囚激洒及其产物表达

?

”

{≮线段体蹦^损伤

或膜功能异常

但电离辐射如何通过活性氧诱导线粒体DNA的变异；核基因如何编码线粒体诱导凋亡相关的蛋白；核基因如何与线粒体基因合作共同诱导凋亡等许多细节尚需要迸一步深入研究。

电离辐射作为一种致DNA损伤的因素，现已发现它可以诱导线粒体DNA的突变，其中包括4977bp的缺失、点突变、插入突变等。

常见的4977bp片段的缺失被认为与细胞衰老、紫外线照射而受损的皮肤，肌病、帕金森综合征以及进行性外部眼肌麻痹等相关联。

在线粒体DNA（mtDNA）缺失突变中，研究最多的是mtDNA4977bp缺失，许多研究发现mtDNA4977bp缺失与电离辐射、职业性耳聋及某些化合物的接触有关。

目前认为线粒体DNA缺失的机制主要包括：

同源重组、拓扑异构酶分裂和滑

行复制（sli旷replication）。

当mtDNA受到亲电子突变剂攻击时，mtDNA环形链打

开，在延伸过程中这种正向重复序列可能发生错配。

对于辐射诱导线粒体DNA缺失

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的发生，可能为同源重组的机制，因为在辐射造成的DNA双链断裂后，修复率很低，正向重复序列的错配，造成了4977bp的缺失。

人类mtDNA4977bp的缺矢莅于mtDNA序列的13bp的正向重复序列（5’．ACCTCCarCACC．3’），即8470"--"8482和

13447．13459之间口3，该重复序列为mtDNA4977bp缺失的结构基础。

二、本研究的国内外研究进展随着科学的进步，研究手段的不断改进，辐射损伤的生