分子生物学10个主干实验步骤精.docx

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分子生物学10个主干实验步骤精

《生物学实验四》实验操作步骤

2010年3月

实验一、细菌培养、细胞培养

大肠杆菌培养

（1）大肠杆菌是以DNA扩增或者以表达外源基因为目的最常用的基因工程菌。

将含有目的基因的重组质粒或重组噬菌体导入大肠杆菌，并将该大肠杆菌在合适的培养基中培养、增殖，就可扩增目的基因。

（2）大肠杆菌培养包括固体和液体培养基的制作，平板培养、复壮培养和大量液体培养。

根据培养目的分为DNA扩增培养和蛋白质的表达培养。

分子生物学实验使用的大肠杆菌主要是K12株的衍生菌株，用于重组的常用菌株有HB101、JM109、DH5α等,用于表达的常用菌株有BL21（DH3）等。

（3）大肠杆菌培养的操作大多在超净工作台内进行。

超净工作台内常用的主要实验器具有：

培养皿、培养试管、培养瓶、移液枪、白金接种环、接种棒、竹针、牙签、煤气灯或酒精灯等。

超净工作台使用前要用70%酒精和紫外灯消毒。

（4）大肠杆菌的最适培养条件也是大多数霉菌和其它细菌的最适生长条件，为此，一切大肠杆菌培养用的试剂和器具必须灭菌。

灭菌的方法有高压蒸气灭菌、干热灭菌、火焰灭菌、紫外线和酒精杀菌等。

蒸气高压灭菌前，洗净的器具以及培养基等要用铝膜、牛皮纸等包裹好，灭菌条件为121℃，20min。

（5）平板制作：

打开培养瓶塞，摇匀培养基，将培养瓶口在酒精灯上消毒，打开灭过菌的培养皿，分注培养基，培养基凝固后倒置培养皿，用灭菌口袋或牛皮纸包装后4℃冷却备用。

划线培养：

将白金接种环在酒精灯上消毒，冷却后将白金接种环前端轻沾菌液后在固体平板培养基表面划线接种。

倒置培养皿37℃培养一夜。

（6）液体培养：

用灭菌牙签在平板培养基上挑选单菌落，将沾有单菌落的牙签放入2～3ml培养基的培养试管内，37℃、200～250r/min振荡培养一晚（8～16小时）。

复壮后的菌株可进一步大量液体培养，用于质粒大量扩增或蛋白质表达。

取2～3ml经复壮的菌液放入装有200～300ml培养基的锥形瓶内扩大培养，37℃、200～250r/min振荡培养至OD600为0.6左右。

昆虫细胞培养

详见《昆虫细胞培养》多媒体

实验二、昆虫病毒DNA的分离、纯化和鉴定

　1、2ml病毒感染的培养细胞悬浊液

↓8000r/min4℃10min，去上清

2、加PBS漂洗混匀

↓8000r/min4℃10min，去上清

3、加250μlTE悬浊

↓

4、加250μlLysis　Buffer裂解细胞

↓

5、加20μlProteinaseK（10mg/ml）

↓50℃4h/37℃过夜

6、加3μlRNaseA（10mg/ml）

↓37℃30min

7、加等体积酚-氯仿

↓12000r/min4℃/10min

取水相（剪枪头，烤平）

8、重复步骤7

9、水相加1/10体积3mol/LNaAC（pH4.8）

↓

10、加2倍体积的无水乙醇沉淀病毒DNA

↓-20℃，过夜

↓12000r/min4℃/5min，去上清

11、70%乙醇洗涤沉淀

↓12000r/min4℃/5min

去上清

12、重复步骤11

13、适量TE溶解

↓

14、电泳鉴定

实验三、PCR扩增昆虫杆状病毒基因及其产物的鉴定

1.PCR反应体系:

TaqDNA聚合酶0.5μl

10×PCRBuffer5μl

dNTP4μl

Template（病毒基因组DNA）1μl

Primer11μl

Primer21μl

ddH2O37.5μl

——————————————————

Total50μl

2、PCR反应程序：

94℃3min

94℃30s

55℃30s35cycles

72℃1min

72℃10min

4℃forever

实验四、质粒DNA（pMD-B7-2ScFv和pET32a）的分离、纯化和鉴定

1.将菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜

↓

2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，4℃3000r/min离心5min

↓

3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥

↓

4.碱法少量快速抽提质粒DNA（详见4）

↓

5.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定（详见5）

4.碱法少量快速抽提质粒DNA

单菌落Sup

↓接种↓

3mlLB培养基（含Amp或Kan100ug/ml）add等体积酚：

氯仿（1：

1）

↓↓混匀

37℃200rpm振荡过夜培养4℃、12000rpm、10min↓

↓Sup

↓

取1.5ml培养物于Eppendorf管内add2×Vol无水EtOH

↓↓混匀4℃、3000rpm、5min-20℃30min以上

↓↓

PPT12000rpm、10min

↓↓

add100ulSolⅠPPT

↓mixonice10min↓

add200ulSolⅡadd70%EtOH

↓轻轻颠倒数次，混匀，onice10min↓混匀

add150ulSolⅢ8000rpm、5min↓快摇数次，onice10min↓

4℃、12000rpm、10minPPT↓↓

Sup晾干或真空抽干

↓↓

add等体积酚20-40ulTE↓↓

4℃、12000rpm、10min-20℃保存

↓

5.琼脂糖凝胶电泳

（1） 制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb

0.35-60

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2-4

2.00.1-3

称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20ml1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，冷到60℃左右时按100ml的凝胶加5μl的goldview。

（2）胶板的制备

▲ 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

▲将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

▲将冷到60℃左右时的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

▲ 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。

▲ 加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（3）加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。

（4）  电泳鉴定

▲接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

▲当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备

1.从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

↓

2.取0.5ml菌液转接到一个含有100mlLB液体培养基（无抗生素）锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h。

（此时，OD600≤0.4-0.5，细胞数务必<108/ml，此为实验成功的关键）。

↓

3.吸菌液50ml加入离心管中，冰上放置10min，然后4000r/min4℃离心10min，回收细胞。

↓

4.用冰预冷的0.1mol/LCaCl210ml轻轻悬浮沉淀,冰上放置15-30分钟。

↓

5.4000r/min4℃离心10min，回收细胞。

↓

6.再用冰预冷的0.1mol/LCaCl2（含甘油）2ml重悬沉淀，分装到1.5mlEP管中，200ul/管。

↓

7.在-4℃下可保存2周（2-4d时，转化效率最高）。

此细胞为感受态细胞。

实验六、目的基因（B7-2ScFv）的PCR扩增及回收

1、 PCR反应体系:

在0.5mlEppendorf管内配制25μl反应体系：

模板1.0μl

10×buffer2.5μl

dNTP1.0μl

引物11.0μl

引物21.0μl

Taq酶0.5μl

ddH2O18.0μl

总体积25μl

2、 PCR反应程序：

①、94℃预变性3min

②、94℃变性45sec

③、58℃退火45sec

④、72℃延伸60sec

⑤、重复步骤②-④30次；

⑥、72℃延伸10min

、4℃forever

3、 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制0.8%琼脂糖凝胶，取25μl扩增产物电泳。

保持电流40mA。

电泳结束后，紫外灯下观察结果。

4紫外灯下，切割目的片段。

5按照琼脂糖凝胶回收Kit说明书操作回收目的片段。

-20℃保存（见附件）。

附件：

小量DNA片段快速回收试剂盒操作步骤

1、用TAE或TBE缓冲液配制琼脂糖凝胶，对目的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。

2、在紫外灯下切下目的条带，尽量将不含有DNA片段的空白凝胶切掉，以节约溶胶液，并提高回收效率。

胶的体积尽量控制在100ul（约0.1g），以免因必须加入过多溶胶液导致液体外溢。

如果需要对大于100ul体积的凝胶进行回收，请将凝胶切成小块分多管操作。

3、估算胶块体积（可以按胶块密度为1g/ml将胶块在EP管中称重后计算），按100ul胶块加500ul溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，或55℃～65℃溶胶约10min，其间偶尔摇动至胶块完全溶解。

4、胶块完全溶解后将溶胶液转移至吸附柱中，室温12，000rpm离心30s；去掉废液。

●重复步骤4有助于将废液中残余的少量DNA吸附至柱上，增加DNA结合效率，使回收率从约90%左右，提高到约95%。

5、向吸附柱中加入500ul漂洗液（Washbuffer），12，000rpm离心30s；去掉废液。

●请确认漂洗液中已按比例加入无水乙醇。

6、重复步骤5，倒掉废液后空管12，000rpm离心2min以完全去除漂洗液。

●必要时可将吸附柱开盖置于洁净空气放置5min，否则残存的乙醇会影响后续酶促反应。

7、将吸附柱移至一个干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央加入适当体积的洗脱缓冲液（Elutionbuffer,通常用30ul-50ul）或者去离子水，室温放置1-2分钟，12，000rpm离心2min洗脱DNA。

●将洗脱液预热至70℃加入到吸附柱中有助于洗脱。

●洗脱的最小体积不应小于25ul，当需要回收的DNA片段浓度较大时，用户可以调整洗脱缓冲液的体积。

●第一次洗脱后，柱上往往还挂有适量DNA，重复步骤7，最后将洗脱的体积合为一管可以获得更高回收效率。

一次洗脱回收的理想收率为80%-90%，两次洗脱的理想收率能达到85%-95%。

实验七、重组质粒的连接、转化、筛选和鉴定

1. 酶切

酶切体系体积/μl

质粒pET32a7

EcoRI0.5

SalI0.5

10xHbuffer2

DDH2O10

20μl

37℃静置2-3h。

琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶回收目的片段。

酶切体系体积/μl

质粒pMD-B7-2ScFv17

EcoRI0.5

SalI0.5

10xHbuffer2

20μl

37℃静置2-3h。

琼脂糖凝胶电泳鉴定,割胶回收目的片段。

2.连接

将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶

1μl，16℃保温过夜，并做转化实验。

连接体系体积/μL

B7-2ScFv6

PET32a1

 T4DANligase1

10XT4DANligasebuffer1

DDH2O1

10μl

3.连接产物的转化、筛选和鉴定

（1）从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上

↓

（2）加入连接产物质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10μl）,轻轻摇匀,冰上放

置30分钟后

↓

　（3）42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟

↓

　　（4）向管中加入800μlLB液体培养基（不含抗生素）,混匀后37℃振荡培养1小时,使

细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因

↓

　（5）将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含氨苄的筛选平板上,正面向上放置半小时,

待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时

注：

同时做两个对照:

　　对照组1:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

　　对照组2:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

实验八、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及其产物的分离纯化

1.含B7-2ScFv的表达菌株在LB培养基中预培养过夜。

↓

2.10mlLB培养基加入10μl上述过夜培养的LB培养基，37℃恒温摇床，220r/min,培养2h左右。

↓

3.加入10μl1mol/LIPTG,终浓度达1mmol/L，进行B7-2ScFv的诱导表达，37℃恒温摇床，220r/min，继续培养4～5h。

↓

4.各组取1ml上述菌液于EP管，6000r/min离心10min，弃上清，留沉淀，-20℃保存。

其余的菌液集中于大离心管中，6000r/min离心10min（每4组共取30ml于离心管），弃上清。

用10ml溶液I充分悬浮沉淀，6000r/min离心10min，弃上清，留沉淀。

↓

5.用10ml溶液I充分悬浮沉淀，超声波（2s/2s/400W,200次）破碎细胞，6000r/min离心10min，弃上清。

↓

6.用10ml溶液Ⅱ充分悬浮沉淀，6000r/min离心10min，弃上清，留沉淀。

↓

7.重复步骤6。

↓

8.用10ml溶液Ⅲ充分悬浮沉淀，6000r/min离心10min，弃上清，留沉淀。

↓

9.用10ml溶液Ⅲ充分悬浮沉淀，各组分别取1ml悬浮液留样6000r/min离心10min，弃上清，留沉淀，-20℃保存。

其余的悬浮液6000r/min离心10min，弃上清，沉淀-20℃保存。

↓

10.用2ml变性液吹打悬浮沉淀，4℃过夜。

↓

11.10000r/min离心10min，取上清。

↓

12.将上述溶液缓慢加入到已平衡好的His柱。

↓

13.用5mlbufferA洗柱除杂。

↓

14.用5ml洗脱液洗脱目的蛋白，同时用EP管接收。

实验九、表达产物的SDS-PAGE和westernblot鉴定

培养至对数生长期,加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导表达3h，同时设置空的BL21、诱导的空质粒以及未诱导的重组质粒为对照组，离心收集菌体，1SDS电泳上样缓冲液混匀，100℃加热3-5min，上样，每孔30μl，加10μl蛋白预染Marker，进行SDS-PAGE。

20ml分离胶（12%）的配制:

  ddH2O6.6ml

  30%储备胶8.0ml

  1.5MTris-HCl5.0ml

  10%SDS0.2ml

  10%AP0.2ml

 加TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）8μl，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

（凝胶完全聚合需30-60min）

3ml浓缩胶的配制：

ddH2O2.1ml

30%储备胶0.5ml

1MTris-HCl0.38ml

10%SDS0.03ml

10%AP0.03ml

TEMED3μl

将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

根据预染Marker位置以及估计的B7分子（40kDa）裁胶（留3条Marker条带），把NC膜剪成四边比胶大1mm左右的大小（带手套剪，膜上不要沾上油脂）。

夹心放置顺序：

黑板-海绵-滤纸-凝胶胶片-NC膜-滤纸-海绵-白板（浸入转膜缓冲液中，胶膜间不要有气泡）

在冷却条件下，150mA电转1.5h。

把膜加入含5ml5%脱脂奶粉的TTBS封闭液，一次性手套封口，室温摇床封闭30min。

倾去封闭液，以含1:

1000稀释的鼠抗His-Tag抗体的封闭液代替（5ml封闭液加5μl一抗），室温摇床摇动30-60min。

膜放入培养皿中，20mlTTBS摇床洗膜3次，每次10-15min。

再以含1:

5000稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG抗体孵育30-60min（5ml封闭液加1μl二抗）。

同上TTBS洗膜3次。

培养皿中加入20mlTTBS中，避光加入两个芝麻粒大小的3-3’二氨基联苯（DAB）粉末和10μlH2O2，将膜放入，避光10min，观察杂交结果。

实验十、RT-PCR技术及反应产物的鉴定

1.感染病毒的斜纹夜蛾细胞总RNA的提取

适量的染病毒斜纹夜蛾细胞

加入适量的RNAisoReagent后匀浆

室温静置5分钟

震荡混匀

加入200μl氯仿

室温静置5分钟

12，000g4℃离心15min

将上清转移至新的离心管中

加入与上清液等体积的异丙醇

室温静置10min

12，000g4℃离心10min，弃上清

向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀

12，000g4℃离心5min

弃上清保留沉淀

室温干燥

溶解于适量的DEPC处理水中

2.RT-PCR反应

（1）按下列反应组成配制反应液

MgCl22μl

10XRNAPCRBuffer2.5μl

dNTPMixture1.0μl

RNaseInhibitor0.5μl

AMVReversetranscriptase0.5μl

Oligod-TPrimer0.5μl

实验样品RNA1.0μl

RNaseFreeH2O17.0μl

Total25.0μl

（2）按照以下条件进行转录反应

30℃10min

42℃1h

70℃15min

4℃5min

（3）按下列反应体系配制反应液

10XPCRbuffer5μl

dNTP1μl

Primer-F1μl

Primer-R1μl

cDNA2μl

Taqpolymerase0.5μl

ddH2039.5μl

Total50μl

（4）按以下条件进行PCR反应：

94℃5min

94℃1min

55℃1min35个循环

72℃1.5min

72℃10min

4℃Forever

（5）反应结束后，取反应液20μl进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。