最新RNA转录与转录后加工.docx

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最新RNA转录与转录后加工

RNA转录与转录后加工

第7章RNA转录与转录后加工

1本章主要内容　

1）转录的基本概念

2）大肠杆菌RNA聚合酶及其转录

3）真核生物的RNA聚合酶及其转录

4）RNA的转录后加工和反转录

2教学目的和要求

通过本章学习，掌握转录的基本概念，原核转录的主要参与者（RNA聚合酶和启动子）以及原核转录的过程（起始、延伸和终止）。

1）掌握真核转录的三种主要RNA聚合酶、所转录的基因类型和参与转录过程各种因子等。

2）了解不同前体RNA的加工机制。

3）了解反转录的特点

3重点难点

1）转录

2）大肠杆菌RNA聚合酶、原核转录的过程

3）真核生物的RNA聚合酶、真核转录过程、转录因子

4）RNA的转录后加工、反转录

4教学方法与手段

讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。

5授课内容

1）RNA转录概述

2）细菌基因的转录

3）真核生物的转录

4）RNA的转录后加工

5）RNA的反转录

第一节RNA转录概述

一、信使的发现

•1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验：

–若加入RNA酶，则蛋白质合成就停止；

–若再加入来自酵母的RNA，又可合成蛋白质。

这表明什么？

•同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体——

•发现标记的RNA在核内。

•标记追踪实验：

经过一段时间又发现被标记的RNA在细胞质中，

•这表明什么？

•1956年E.Volkin和L.Astrachan：

•用同位素脉冲一追踪标记

•表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和自身的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同。

T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA。

•这表明什么？

•最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验：

•将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交。

•结果这种RNA只能和T2的DNA形“杂种”链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。

Jacob和Monod预言:

（1）这种“信使”应是一个多核苷酸；

（2）其分子平均不小于5⨯105bp,足以携带一个基因的遗传信息；

（3）它们至少是暂时连在核糖体上；

（4）其碱基组成反映了DNA的序列；

（5）它们能高速更新。

Jacob和Monod将它定名为:

信使RNA（MessengerRNA）或mRNA。

二、几个基本概念

•转录（transcription）:

是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4种rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。

•在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。

•转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。

三、RNA合成的基本特点

•1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶（RNAPol）。

其特点是：

（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；

（2）以DNA为模板；

（3）按5′-3′方向合成；

（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；

（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；

（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；

（7）RNA的序列和模板是互补的。

确定有义链

•1963J.Marmur和DotySpiegelnan区分有义链。

采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料，SP8DNA双链有“轻”、“重”差异明显。

•现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisenstrand），

•非模板链称为有义链（sensestrand）或编码链。

•在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。

•怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5’-3′方向进行的？

•E.coli在0︒C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37︒C每秒就可加上40个核苷酸;

•利用这个差别以14C来标记U,在0︒C培养E.coli，。

•提取这种正在伸长的mRNA分子,发现——

•14C标记首先出现在伸长的3′端，因此可以证明合成是延着5′-3′方向进行的。

四、RNA合成和DNA复制的区别

（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板；

（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母成子链；

（3）RNA合成不需引物,而DNA复制需引物；

（4）转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；

（5）聚合酶系不同。

第二节细菌基因的转录

一、细菌的RNA聚合酶

1.全酶（HoloEnzyme）和核心酶（CoreEnzyme）

（1）全酶（HoloEnzyme）

•用于转录的

•依靠空间结构与DNA模板结合（σ与核心酶结合后引起的构象变化）

•专一性地与DNA序列（启动子）结合

•结合常数：

1014／mol

•半衰期：

数小时（107／mol1秒以下）

•转录效率低，速度缓慢（σ的结合）

（2）核心酶（CoreEnzyme）

•作用于转录的延伸过程（终止）

•依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）

•非专一性的结合（与DNA的序列无关）

•结合常数：

1011／mol

•半衰期：

60秒

E.ColiRNApol的亚基组成

coreenzyme

（3）全酶的组装过程

•此外，新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚。

2.各亚基的特点和功能

（1）σ因子

•σ因子可重复使用

•修饰RNApol构型

•使HoloEnzyme识别启动子的SextamaBox（－35区）,并通过σ与模板链结合

E.coli中不同的σ因子可识别不同的启动子

（2）α因子

•核心酶的组建因子

•促使RNApol与DNA模板链结合

•前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链

•尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链

（3）β因子

•完成NMP之间的磷酸酯键的连接;

•Editing功能（排斥与模板链不互补的碱基）;

•与Rho（ρ）因子竞争RNA3’－end;

•构成Holoenzyme后,β因子含有两个位点;

•Isite（initiationsite.Rifs）:

该位点专一性地结合;

•ATP或者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）;

•Esite（elongationsiteRifR）:

对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）.

（4）β’因子

•参与RNA非模板链（sensestrand）的结合（充当SSB）

•有义DNA链结合位点（β’亚基提供）

•DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）

•双链DNA解链位点（前端α亚基提供）

•单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）

•σ因子作用位点

原核生物RNApol（Core）的结构与功能

RNApol执行多种功能

（1）识别DNA双链上的启动子；

（2）使DNA变性在启动子处解旋成单链；

（3）通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链；

（4）最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。

二、原核生物转录的起始延伸

1．启动子（promoter）的结构和功能

启动子（promoter）：

是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。

启动子由两个部分组成

●上游部分—CAP-cAMP结合位点：

（基因表达调控的正控制位点）

CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白

●下游部分—RNApol的进入（结合）位点

－35~－10

包括识别位点和结合位点（RB位点）

2．RNA聚合酶的进入位点

（1）Sextama框（SextamaBox）

–-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点

–RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点，

为转录选择模板——识别位点（R位点）

–大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45

–重要性:

很大程度上决定了启动子的强度（RNApol的σ因子）

（2）Pribonow框（PribonowBox）

•-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnowbox）。

•-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点——结合位点（B位点）

•一致序列：

T80A95T45A60A50T9（TATPUAT），因此又称TATABox

•位置范围－4到－13

（3）转录起始位点（I）

•＋1位点

•RNA聚合酶的转录起始位点

•转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G

•而且位置固定

典型启动子的结构

3．起始过程

（1）全酶与模板DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；

（2）起始识别：

全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinarycomplex）；

（3）全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；

（4）酶移动到I，第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）。

图起始过程

图RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:

①σ和1/3的RNApol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中；

②其中半数的核心酶从事转录；

③余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中；

④估计数量很少的全酶是游离的。

4．RNA链延伸

三原核生物转录的终止

1．终止子的种类

（1）不依赖ρ因子的终止子（内在终止子）：

体外实验中，只有核心酶和终止子就足以

使转录终止

（2）依赖ρ因子的终止子：

蛋白质辅助因子

－－ρ因子存在时，核心酶终止转录

两者有共同的结构特征（序列差异）

①不依赖ρ因子的终止子（强终止子）

•结构特征:

☻一是形成一个发夹结构

茎….7~20bp的IR序列形成（富含G/C）

环….中间不重复序列形成

发夹结构的突变可阻止转录的终止

☻二是6~8个连续的U串（发夹结构末端）

②、依赖ρ因子的终止子

a结构IR序列中的G／C对含量较少

发夹结构末端没有固定特征

b靠与ρ的共同作用而实现终止

2．原核生物转录的终止

（1）不依赖ρ因子的终止子终止转录

①新生RNA链发夹结构形成造成高度延宕（典型的有60秒左右）

②RNApol暂停为终止提供了机会，6~8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号

RNA－DNA之间的rU－dA结合力较弱

于是：

RNA－DNA解离→三元复合体解体

→RNApol解离→转录终止

③真正的终止点不固定，在U串中的任何一处

④IR序列和U串同等重要

IR中的G／C对含量的减少

U串的缩短或缺失

⑤DNA上与U串对应的为富含A／T的区域

说明：

AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用

（2）依赖ρ因子的终止子终止转录

①通读（readthrough）：

ρ因子的转录终止过程中，RNApol转录了IR序列之后，虽发生一定时间的延宕，但如果没有ρ因子存在，则RNApol会继续转录

②ρ因子

a、活性形式为六聚体

促进转录终止的活性，NTPase活性

b、RNA长度大于50nt时，依赖RNA的NTPase活性最大

说明：

ρ因子识别和结合的是RNA

③ρ因子对终止子的作用

a、ρ因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5’端）

b、ρ因子沿RNA从5’→3’移动（NTP水解供能）（终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会）

c、ρ因子与RNApol相互作用而造成转录的终止

RNAPol转录DNA

●ρ因子附着到RNA识别位点上

●ρ因子跟在RNAPol后沿RNA移动

●RNAPol在终止位点停下，并被ρ因子追上

●在转录泡中ρ因子使DNA-RNA杂种双链解开

●转录终止,释放出RNAPol,ρ子和RNA

④终止反应还需要RNA与DNA的相互作用

•即：

需要一定的RNA序列

•因为：

其与模板的结合力必须弱到一定数

值，才能配合ρ因子与RNApol的作用

（发夹结构下游的AU序列）

•序列不同的终止子→不同的终止程度→基因表达调控的途径之一

要点回顾

◆几个基本概念

5’----GCAGTACATGTC-----3’编码链DNA

3’----CGTCATGTACAG-----5’模板链

5’----GCAGUACAUGUC-----3’mRNA

N-----Ala--Val--His--Val------C蛋白质

Ø不对称转录

1.DNA双链上，一股链可转录，另一股不转录。

2.有意义链与反意义链并非固定不变。

3.转录方向都是5’→3’

◆原核生物的RNA转录

Ø原核生物RNA聚合酶

大肠埃希菌RNA聚合酶的组成

（1）全酶（holoenzyme）

由4种（5个）亚基α2ββ’σ组成

（2）核心酶（coreenzyme）

α2ββ’，参与转录的全过程

（3）σ亚基

亦称σ因子（σfactor）—转录辅助因子

识别启动子，不参与转录过程

Ø转录过程（起始、延长、终止）

ÐDNA模板

启动子（promoter）

1）概念:

转录开始时能与RNA全酶结合的DNA顺序（双链）

2）原核生物启动子的特点:

①DNA序列在转录起始点的5’端区（上游区）

②-10bp处-TATAAT-（Pribnowbox）

③-35bp处-TTGACA-（SextamaBox）

Ð起始过程

v封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinarycomplex）；

v开放的启动子二元复合体（openedbinarycomplex）；

v酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）。

Ø终止

终止的方式

•ρ-因子的作用

•与新生RNA结合

ATP供能

ρ-因子沿新生的RNA单链推进

新生的RNA单链从DNA模板上分离下来

第3节真核生物的转录

一真核生物的RNApol

1．真核生物的RNApol

2．位置和转录产物

●RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA（7.8S、18S、28S）

●RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录

•hnRNA（mRNA前体，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）

•snRNA（核内小分子RNA，smallnulearRNA）

表6-2真核生物的三种RNA聚合酶的特点

RNAPol

位置

产物

相对活性%

对α-鹅膏蕈敏感

PolⅠ

核仁

28S,18S,7.8SrRNAs

50～70

不敏感

PolⅡ

核质

hnRNA,mRNA,某些SnRNA

20～40

高度敏感

PolⅢ

核质

tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs

～10

片段特异,中等敏感

3．亚基组成：

•RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都由多个亚基组成。

有些亚基是三种酶所共有。

•mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的，需经常重新合成。

因此RNA聚合酶Ⅱ是三种酶中最活跃的。

表6-3真核生物聚合酶的成分及功能

4．RNApolⅡ亚基组成：

分子量500KDa,含两个大亚基和7~12个小亚基

●大亚基中有C末端结构域（carboxyterminaldomain，CTD）

●CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复

●Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－Ser

C端重复七肽，

●不同生物中重复数目不一样（酶活性）

二真核生物的启动子

三种RNApol→三种转录方式

三种启动子→三类基因，Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类

•1、RNApolⅡ的启动子——Ⅱ型启动子

•2、RNApolⅠ的启动子——Ⅰ型启动子

•3、RNApolⅢ的启动子——Ⅲ型启动子

1．RNApolⅡ的启动子

即Ⅱ型启动子

•结构最复杂

•位于转录起始点的上游,由多个短序列元件组成

•通用型启动子（无组织特异性）

（1）帽子位点（capsite）：

转录起始位点

（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）

•位于－30处

•一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）

•定位转录起始点的功能（类似原核的Pribnow框）

•TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的。

（3）CAAT框（CAATbox）

（4）增强子（enhancer）

（5）GC框（GCbox）

•位于－90附近，较常见的成分

•核心序列为GGGCGG

•可有多个拷贝，也可以正反两方向排列

（6）其他元件：

•八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）

一致序列为ATTTGCAT

•B元件一致序列为GGGACTTTCC

•ATF元件一致序列为GTGACGT

•还有一些位于起始点下游的相关元件

（7）不同元件的组合情况

不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异，例如：

SV40的早期启动子中有6个GC框。

真核生物启动子示意图

RNApolⅡ的启动子小结：

★不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同

★不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交启动子功能没有变化

★各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定了转录的起始

2．RNApolⅠ启动子

•即Ⅰ型启动子，由2部分保守序列组成：

•核心启动子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于-45到+20，负责转录的起始。

•上游控制元件（upstreamcontrolelement,UCE），从-180延伸到-107，

可增加核心元件的转录起始的效率。

3.RNApolⅢ启动子

（1）分为二类，每种识别方式不同

a、下游启动子（内部启动子）

位于转录起始点的下游

5SRNA和tRNA基因

可分为两类

b、上游启动子snRNA

（2）内部启动子的发现

最早发现于非洲爪蟾的5SrRNA基因

试验设置：

★非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，进行缺失试验

★以不同长度的5SrRNA基因为模板进行转录。

结果：

缺失＋55以前和缺失＋80以后的序列都能正常转录，缺失＋55到＋80序列不能转录。

结论：

★5SrRNA基因的启动子位于基因内部

★该启动子可使RNApolⅢ在其上游的55bp处起始转录

（3）内部启动子分为两类

均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开

第一类：

含A框和C框（5SrRNA基因）

第二类：

含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）

间隔序列长短差异很大

☻其中内部启动子起被RNApolⅢ识别的作用

图6-23真核RNAPolⅢ的基因内启动子和基因外启动子

三真核生物转录的起始

♫三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力

♫转录起始过程需要很多的辅助因子（转录因子）参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物，协助RNApol定位于转录起始点。

★RNA聚合酶Ⅱ催化的转录起始

•RNA聚合酶Ⅱ催化各种前体mRNA的合成

•需要多种TF参与：

TFⅡA-J

•真核生物的转录起始是在转录因子（TF）的协助下，RNA聚合酶辨认结合转录起始点上游的DNA序列（启动子），生成起始前复合物。

RNApolⅡ的转录起始

★RNApolⅠ的转录起始

•需要二种辅助因子：

UBF1、SL1

★RNApolⅢ的转录起始

表6-6RNApolⅢ启动子的转录因子的结构和功能

因子

结构

功能

TFⅢA

38Kda,有9个锌指

结合于1型内部启动子（5sRNA基因）的C框,使ⅢC结合在C框下游，辅助ⅢB定位结合

TFⅢB

含TBP和另外二种蛋白

定位因子，使Pol结合在起始位点上

TFⅢC

含τA和τB,有5个亚基

τB结合Ⅱ型内部启动子（tRNA基因）的B框，起增强子的作用。

τA结合A框，起启动子的作用；辅助ⅢB定位结合

TBP

是B,ⅡD,SL1的亚基

和特异DNA序列及RNAPol结合，使Pol结合，在正确的位点上

TFⅡD

含TBP亚基

结合TATA框，确定选择PolⅢ

PBP

次近端结合蛋白

可能和ⅡD一道辅助ⅢB定位结合的另一途径

☻TBP的作用

★所有RNApol的转录起始都需要TBP

★在RNApolⅠ的转录起始过程中,TBP是SL1的组份，起定位RNApolⅠ的作用

★RNApolⅡ的转录起始由TBP识别TATA框

★在RNApolⅢ的转录起始过程中,TBP起定位RNApolⅢ的作用

☻TBP起定位作用,所以又称定位因子（positioningfactor）

四转录延伸TranscriptionElongation

1.起始到延伸的转变

★始于第一个磷酸二酯键的形成

★伴随着DNA分子和酶分子构象的变化

（1）Prok.

•起始时，σ因子有利于β和β’亚基具有与DNA专一性结合所要求的构象

•起始后,σ因子解离,β和β’亚基构象发生变化

（2）Euk.多种辅助因子的共同作用来保证这一转变

2．延伸过程

Prok.

★酶与产物RNA不解离

★底物NTP不断加到RNA链的3’-OH端

★形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动

★延伸位点不断地接受新的NTP，RNA链不断延伸

☻始终保持三元复合物的结构

①转录泡

●RNApol结合和转录的DNA模板区域，有17bp左右

●DNA形成解链区

●转录泡处杂交双链很短

─胰脏RNAase——其长度10bp（不准确）

─推测也就两个核苷酸左右

②拓扑学问题

ΦRNA合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变

•RNApol的前沿…..解螺旋作用

•RNApol后端…..DNA的螺旋化

（保持解链区长度约17核苷酸左右）

Φ超缠问题的解决靠DNA旋转酶

ΦRNA