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细胞工程笔记

细胞工程笔记

第一章绪论

一、细胞工程在现代生物技术中的地位

生物技术的概念：

“New”Biotechnologytheuseofcellularandbiomolecularprocessestosolveproblemsormakeusefulproducts.（CB.Feldbaum,2004）

现代生物技术的的主要领域

发酵工程：

利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的术。

如：

当前的食品、医用和农用抗生素绝大部分是发酵产品，此外还包括氨基酸、工业用酶，日常生活中的味精、维生素B2等。

酶工程：

利用酶的催化作用，采用适当的生物反应器工业化的生产人类所需的产品或是达到某一特殊目的的一门生物工程技术。

如：

a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄

糖异构酶三酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产岀高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛、脱胶和洗涤剂工业等；日常生活中的加酶洗衣粉，嫩肉粉等。

基因工程：

根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合，再转入生物体内产生岀人们所期望的产物，或创造岀具有新遗传性状的生物类型的一门技术，又称重组DNA技术。

如：

单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、干扰素、生长因子等药物。

蛋白质工程：

利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分

离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的技术。

又称“第二代基因工程”。

如：

提高葡萄糖异构酶热稳定性、速

效胰岛素、嵌合抗体、治癌酶的改造等。

生物化学工程：

应用化学工程的原理和方法，研究解决生物反应过程中的基础理论

及工程技术问题。

如：

新型生物反应器系统及相关培养和放大技术、工艺的研究与开发，新型分离方法和设备的研究开发，描述生物反应过程的数学模型的建立，生产过程在线检测和控制手段的完善等。

细胞工程地位：

细胞工程是现代生物技术的桥梁和纽带

二、细胞工程学的概念及研究范畴

1、概念和分类

概念：

以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用生命科学理论，以及工程学原理与技术，有目的的利用和改造生物遗传特性或生物学特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。

根据研究对象不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程

2、细胞工程学的研究领域

原生质体培养（protoplastculture）

组织、器官或细胞培养（tissue,organorcellculture）植物胚胎培养（embryoculture）

染色体工程（chromosomeengineering）转基因动植物（transgeneticanimalandplant）动物胚胎移植、胚胎培养和试管动物（embryotransfer,embryoculture,tube

animal）

克隆动物（clonedanimal）

3、细胞工程学的研究任务

细胞、组织或器官的形态发生规律；研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件；细胞融合方法和机理；

植物材料的快速大量繁殖方法；种质资源的离体保存机理和方法；动物胚胎移植、胚胎体外生产及动物克隆技术等；

再生个体的遗传和变异；改良生物品种，创造新的生物种类，为人类造福。

三、细胞工程学发展历史

一）植物细胞工程发展史19世纪末和20世纪初

探索期（1859-1929）、成熟期（1930-1959）和迅速发展期（1960年至今）理论基础：

生物细胞的全能型（totipotency）：

个体或组织、器官已经分化的细胞在适宜的培养条件下具有再生成完整个体的遗传潜能。

1、探索期

1902年GottlichHaberlandt（德.哈泊兰德）根据细胞理论提出植物可以不断

分割至单个细胞，在适当的条件下单细胞具有发育成完整植株的能力。

celltheory

Alllifeformsaremadefromoneormorecells.

Thecellisthesmallestformoflife.

Cellsonlyarisefrompre-existingcells.

"如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立生活和发展"（《细胞

学》Schwann,1839）――这一论点成为组织培养研究的思想基础。

随后，许多科学家从事组织培养研究。

1904年，德国植物胚胎学家Hanning（汉宁）用萝卜和辣根的胚进行离体培养，提早长成了小植株。

常规：

幼胚t（成熟）种子t（发芽）植株

组织培养：

幼胚T（培养）植株

首次获得植物器官（胚）离体培养成功。

1922年，Kotte（德，科特）和Robbins（美，罗宾斯）对豌豆、玉米、棉花等的茎尖、根尖进行了离体培养，发现了培养的分生组织能进行有限的生长。

首次植物组织培养。

1925年，Laibach（德，莱巴赫）进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功得到了杂种植物。

证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性。

2..成熟期

White、Gautheret、Nobecourt等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。

40年代末开始，从脱分化细胞组织培养进入探讨器官再分化的研究。

细胞（组织、器官）t【脱分化】愈伤组织（分生细胞）T【再分化】不定芽、根

（双极性胚状体）T植株

1957年Skoog（美，史库克）和Miller（米勒）提出了植物激素控制器官形成的概念，首次证实IAA/BA的比例是组织培养中控制根和芽形成的重要条件。

1958年Steward（英，斯图尔德）和Reinert（德，雷那特）从胡萝卜根的悬浮细

胞中成功从单个细胞诱导出成熟的体细胞胚，首次证实了细胞全能性学说。

3、迅速发展期

1）原生质体培养和细胞融合

1971年，Takebe（日，塔克伯）等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。

1972年，Carlson（美，卡尔森）等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得

了第一个体细胞杂种植株。

1978年，Melchers（梅尔彻斯）进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株。

2）微繁技术

1960年，Morel（法，莫里尔）提出了利用茎尖离体快速无性繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。

3）花药培养技术

1973年，Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。

4）次生代谢产物生产

1959年，Tulecke和Nickell首先进行了较大规模细胞培养，在一个20L的植物细

胞封闭式悬浮培养系统中，成功培养了银杏、冬青等细胞。

20世纪80年代植物细胞工程技术开始大规模应用于植物遗传改良和快速繁殖，在人工种子、种质资源的保存和细胞培养次生代谢物质也进行了研究和开发。

1985年首批转基因植物（抗虫/抗病毒）开始进行田间试验，1986年美国EPA批

准了转基因烟草的释放。

1994年美国FDA批准了第一个转基因食品FlavrSavrTM西红柿。

二）动物细胞工程发展史

1、培养技术

1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管细胞，并观察到有新的神经细胞生成。

这标志着动物细胞培养的开始。

1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。

1914年，Thomson建立了器官培养技术。

1940年，1951年，Earle和Gey分别建立了C3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系一人体宫颈癌Hela细胞系。

2、细胞融合技术

1958年，Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。

1965年，Harris诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。

1964年，Lifflefield根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基使亲本细

胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。

1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。

该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。

3、多倍体诱导技术

1959年，Swarup用低温处理三棘刺鱼获得了三倍体，并饲养至性成熟。

现在人工

诱导多倍体已成为经济水生动物育种的主要技术。

4、克隆技术

首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾受精卵（经紫外线照射杀死卵细胞核）中，约有1%

的重组卵发育成为成熟蛙。

1997年2月，Wilmut（英）在《Nature》报道了世界第一只克隆羊的诞生。

第二章细胞学基础

2.2细胞增殖、生长与衰亡

细胞增殖（cellproliferation）:

单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。

多细胞生物由一个单细胞即受精卵分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。

成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。

机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。

2.2.1细胞周期（cellcycle）

细胞周期（cellcycle）:

连续分裂的细胞从一次细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束所经历的过程。

DNA合成前期（pre-DNAsynthesis,G1期）

DNA合成期（phaseofDNAsynthesis,S期）

DNA合成后期（post-DNAsynthesis,G2期）细胞分裂期（phaseofcelldivision,M期）有丝分裂（mitosis）减数分裂（meiosis）无丝分裂（amitosis）

2.2.2细胞分裂

细胞分裂（celldivision）：

是细胞一分为二的增殖过程，从而产生新细胞。

无丝分裂特征：

分裂速度快，不岀现染色体和纺锤体等结构，核膜核仁也不消失。

有丝分裂：

即体细胞分裂，通过分裂产生同样染色体数目的子细胞，包括核分裂和

胞质分裂两个过程。

前期（prophase）

中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase）

胞质分裂（cytokinesis）开始于细胞分裂后期，在赤道板周围细胞表面下陷，形成环形缢缩，称为分裂沟（furrow）。

分裂沟的位置与纺锤体和钙离子浓度的变化有关。

胞质分裂开始时，大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组装成微丝并相互组成微丝束，环绕细胞，称为收缩环（contractilering）。

收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。

植物细胞胞质分裂：

与动物细胞胞质分裂不同的是，植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和胞壁而将细胞分开

植物细胞胞质分裂有丝分裂的意义有丝分裂的过程是亲代细胞的染色体复制，再平均分配到两个子细胞中，从而保证了亲、子代两代细胞中含有相同数目和形态结构的染色体，在亲子代之间保持遗传性状的稳定性和遗传性。

减数分裂（MEIOSIS）:

是细胞仅进行一次DNA复制，随后进行两次分裂，染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂，仅岀现在生殖细胞成熟过程中。

减数分裂的意义：

1、遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次，导致染色体数目减半；

2、S期持续时间较长；

3、同源染色体在减数分裂期I（MeiosisI）配对联会、基因重组；

4、减数分裂同源染色体配对排列在中期板上，第一次分裂时，同源染色体分开。

减数分裂的特点：

1、遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次，导致染色体数目减半；

2、S期持续时间较长；

3、同源染色体在减数分裂期I（MeiosisI）配对联会、基因重组；

4、减数分裂同源染色体配对排列在中期板上，第一次分裂时，同源染色体分开。

223细胞衰老

衰老（senescing,aging）是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程。

单细胞生物：

细胞衰老或死亡就是个体衰老或死亡

多细胞生物：

细胞衰老不等同于个体衰老

细胞衰老机制

差错学派

代谢废物积累

自由基学说

线粒体损伤假说

体细胞突变与DNA修复

遗传学派

基因程序理论

复制性衰老（端粒假说）

长寿基因

端粒

由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸的蛋白质复合物。

端粒DNA由非编码的重复序列组成，不同物种的DNA重复序列的重复数不同不同的真核细胞端粒存在类似的DNA序列与结构，且高度保守。

其共同的特征是富含G,而且富含G的链（5'£'）比富含C的链（3'七）突出12〜16个核苷酸。

端粒结合蛋白TBPs:

双链TBPs和单链TBPs。

端粒酶的实质是一种自身携带模板的反转录酶，由RNA和蛋白质亚基组成，能维

持端粒的长度

人端粒酶RNA模板区与端粒的3'末端结合后，利用其本身的片段合成端粒DNA，

到达模板的5'端后，通过移位，又与新合成的端粒DNA结合，合成新的端粒片

段。

（引自GriederC,BlackburnE.In:

Nature1990:

345:

458-460.）

细胞坏死（necrosis）:

指细胞遭受到强烈有害损伤条件（物理、化学、生理）刺激时，岀现的一种被动的、突发性的、非生理性死亡。

表现：

膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，核染色质不规则的位移，线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，胞浆外溢等，从而诱发炎症反应。

细胞凋亡Apoptosis，又称程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）特定的内部或外部因素诱导启动细胞内有基因编码的“死亡程序”，从而导致细胞死亡的过程。

这是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。

•Apoptosis的概念源自于希腊语，原意是指树叶或花的自然凋落；

•细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不遗留疤痕。

•死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。

细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。

细胞质向外出芽，形成膜包围的凋亡小体

凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化

典型的apoptosis症状：

圆形细胞没有微绒毛，互相分离，染色质凝缩成新月状,与核膜相连。

线粒体结构保存完整多核糖体仍然可见，有自动吞噬泡

细胞坏死与细胞凋亡

2.3配子发生与胚胎发育

，指

生物生殖方式：

无性生殖（asexualreproduction）

有性生殖（sexualreproduction）

无融合生殖（apomixis）

有性生殖：

通过性细胞的产生、融合并进一步发育成新个体的生殖方式。

2.3.2受精

受精（fertilization）:

指雌配子（femalegamete）和雄配子（malegamete

合为合子（zygote）或受精卵（oosperm）。

2.3.3胚胎发育

受精卵通过细胞生长、分裂和分化形成各种形态和功能不同的细胞，发育成动植物有机体的过程。

）融

胚盘上、下方出现腔：

羊膜腔amnioticcavity:

上胚层靠滋养层侧。

卵黄囊yolksac:

下胚层靠胚泡腔侧。

原肠作用形成三胚层：

外胚层、中胚层、内胚层2.4细胞分化和细胞决定

2.4.1细胞分化

细胞分化：

在个体发育中，细胞的后代在化学组成、形态结构和功能上产生差异的过程称

为细胞分化（differentiation）。

其本质是基因选择性表达的结果，即基因表达调控的结果。

细胞分化的基本特征：

细胞形态和功能间出现稳定差异

细胞生理状态发生改变

细胞分化潜能逐渐变窄

细胞核分化潜能保持完整

单细胞有机体的细胞分化与多细胞有机体的细胞分化不同之处：

前者多为适应不同的生活环境，而后者则通过细胞分化构建执行不同功能的组织与器官。

多细胞有机体在其分化程序与调节机制方面显得更为复杂。

分化细胞的基本特征：

个体中所有不同种类的细胞的遗传背景完全一样。

分化细胞彼此之间在形态、结构、功能方面的不同是由于其拥有不同的蛋白质所致。

细胞分化中最显著的特点是分化状态的稳定性。

虽然细胞分化是一种相对稳定和持久的过程，但是在一定的条件下，细胞分化又是

可逆的。

根据细胞的特化程度和分裂能力不同分类

无（动物分可逆、根、茎、叶等组织或器官中的细胞,

高度分化不可逆细胞）骨骼纤维细胞、心肌细胞

细胞全能性：

植物细胞各种高度分化的细胞和组织都具有细胞全能性。

细胞核全能性：

动物细胞随分化程度的提高分化潜能逐渐变窄，但对于细胞核而言,

高度分化的细胞保留着物种的全套基因，仍具有发育全能性。

干细胞：

具有无限的或可被延长的自我更新和分化成不同组织细胞类型的能力的细

胞。

按来源分：

胚胎干细胞和成体干细胞（造血干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞、

神经干细胞）

按功能分：

全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞

造血干

细胞

多能定向干细胞

单能定向干细胞

成熟子代细胞

髓系干细胞

红系干细胞

粒、单核系干细胞

巨核干细胞

红细胞

粒细胞/单核细胞

血小板

淋巴系干细胞

前驱B细胞

前驱T细胞

B细胞

T细胞

干细胞具有以下几个特点:

分化程度

进行有丝分裂

能力

举例

表皮基细胞，精原细胞、植物生长点细胞

1干细胞本身不是终末分化细胞；

2干细胞能无限的分裂；

3干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途径中选择其一：

或保持亲代特征，仍作为胞；或不可逆地向终末分化。

干细

有一定程度

细胞决定可看作发育潜能逐渐限制的过程，决定先于分化。

花粉母细胞和花粉之间的一系列细胞、动物精原细胞和精子之间的一系列细胞等。

2.4.2细胞决定（celldetermination）

概念：

细胞在发生可识别的形态和功能变化之前，就已受到约束而向着特定方向分化，这种细胞的发育命运被稳定地确定的过程称为细胞决定。

胚胎细胞分化的潜能与决定的关系：

植物细胞：

第一次细胞分裂（极性）

哺乳类动物胚胎细胞：

16细胞期

两栖类胚胎细胞：

三胚层形成（细胞空间关系的改变和微环境的差异）

卵细胞质在早期胚胎细胞决定中的作用：

从受精卵第一次卵裂开始，细胞核就受到内

环境（即不同的卵细胞质）的影响。

细胞质中决定细胞命运的特殊信号物质称为细胞质决定子（cytoplasmicdeterminants）。

决定子支配着细胞分化的途径。

受精卵在

数次卵裂中，决定子一次次地被重新改组、分配。

卵裂后，决定子的位置固定下来，并

分配到不同的细胞中，子细胞便产生差别。

卵细胞质的母体效应（maternal-effect）:

卵母细胞中贮存的mRNA和蛋白质的分布是不均匀的，各种mRNA在细胞中都有定位分布，并随卵裂进入不同的子细胞中。

细胞决定的稳定性和遗传性：

细胞决定一旦发生，就沿着决定方向分化成特定细胞类型，这种分化具有稳定性和遗传性。

2.4.3细胞分化中的核质关系

细胞质对细胞核的作用：

影响细胞核基因的表达。

当鸡的红细胞与培养的人Hela细胞（去分化的癌细胞）融合后，核的体积增大20倍,染色质松散，出现RNA和DNA合成，鸡红细胞核的重新激活是由于Hela细胞的细胞质调节的结果；

将培养的爪蟾肾细胞核注入蝾螈的卵母细胞内，分析蛋白质合成情况发现，原来在

肾细胞中表达的基因，这时不表达，而原来不表达的基因，这时却被激活。

细胞核对细胞质的作用：

个体的发育受细胞核的控制。

部分基因被激活，导致特异蛋白的合成，执行不同功能，引起细胞分化。

生物基因组中基因分类：

1.持家基因：

维持细胞生存所必须的基因。

2.组织专一性

基因（奢侈基因）：

在各种组织细胞中专一性选择表达的基因。

细胞质与细胞核在细胞分化过程中具有非常密切的协调关系，未分化或已分化的核与细胞质协调而发生正常的分化，发育成正常的胚。

第三章细胞工程实验室及基本操作

外植体：

离体条件下生物有机体的各部分组织、器官或细胞，统称为外植体。

第一节实验室及仪器设备

一、实验室

准备室：

洗涤、培养基的配置和消毒

无菌操作室：

超净工作台和附属设备

培养室：

光源、培养架、温度和湿度等控制设备

鉴定实验室：

显微镜、离心机、电泳仪、紫外分光光度计等细胞学和生理生化设备移栽驯化基地：

温室、移栽基质、环境控制设备等

准备室（洗涤区、灭菌区、储藏区、配置区）一一明亮、通风

无菌操作室（缓冲准备区、接种区）一一封闭性好，干燥清洁，保持无菌

培养室一一控制光照和温度，保持干燥和清洁

鉴定实验室一一清洁、明亮、干燥

二、仪器设备

基本设备

灭菌设备

无菌操作设备

细胞培养设备

观察分析仪器设备

三、培养器皿及实验用具

玻璃器皿

新型材料器皿

金属材质用具

第二节基本操作

清洗

消毒灭菌

无菌操作接种技术

一洗涤

玻璃器皿

新器皿上附有游离的碱性物质。

洗涤剂T清水T1%的HCI溶液T清水T蒸馏水T干燥除去残渣-洗涤剂-清水-蒸馏水-干燥

洗净的玻璃器皿不应在器壁上带有水珠，否则冲洗，如果仍挂有水珠，则需要洗涤液浸泡数小时（或用去污粉擦洗），重新清洗。

塑料器皿

质地软，附着力强。

购买无毒并已经消毒灭菌密封包装的一次性商品，直接使用。

用后立即浸入水中-2%NaOH-清水-5%盐酸-清水-蒸馏水-

干燥

金属器械

不宜用各种洗涤液，一般用酒精擦洗，并保持干燥。

不锈钢制品也可用洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，蒸馏水冲洗1〜2次，晾干（或烘

干）。

其他用途的玻璃制品吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品：

需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取岀后经流水冲洗半小时左右，再用蒸馏水冲洗1〜2次，然后烘干或晾干。

载玻片和盖玻片：

洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取岀后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。

二、消毒灭菌

消毒：

指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法。

灭菌：

指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。

分类：

物理方法：

物理灭菌干热、湿热、射线处理；物理除菌过滤、离心沉淀等

化学方法：

消毒剂、抗菌素灭菌

1、干热灭菌

a.灼烧灭菌法：

利用火焰直接把微生物烧死。

【适用范围】接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌，此法彻底可靠，灭菌迅速，

【缺点】易焚毁物品，所以使用范围有限。

b.干热空气灭菌法：

利用烘箱进行烘烤灭菌的方法。

【要求】即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，150'C/40min或120°C/2h，

有的（芽胞杆菌）甚至1