临床医学检验考试辅导《微生物检验》厌氧性细菌及检验讲义.docx
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临床医学检验考试辅导《微生物检验》厌氧性细菌及检验讲义
厌氧性细菌及检验
●考点
概念及分类
分布与临床意义
厌氧菌标本的采集与送检
分离与鉴定
常见厌氧性细菌
【内容讲解】
一、厌氧菌概述
概念：
一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。
分类：
二、厌氧菌感染
（一）厌氧菌在正常人体的分布及感染类型
1.厌氧菌在正常人体的分布
正常人的肠道、口腔、阴道等处均有大量的厌氧菌寄居。
厌氧菌与需氧菌和兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，其中绝大多数为无芽胞厌氧菌。
其中肠道中的厌氧菌数量是大肠埃希菌的1000～10000倍。
表5-22-2重要的厌氧菌种类及其在正常人体内的分布
--------------------------------------------------------------------------
厌氧菌 皮肤 上呼吸道 口腔 肠道 尿道 阴道
--------------------------------------------------------------------------
一、芽胞菌
革兰阳性杆菌
梭状芽胞杆菌属 0 0 ± ＋＋ ± ±
二、无芽胞菌
（一）革兰阳性杆菌
乳杆菌属 0 0 ＋ ＋＋ ± ＋＋
双歧杆菌属 0 0 ＋ ＋＋ 0 ±
优杆菌属 ± ± ＋ ＋＋ 0 ±
丙酸杆菌属 ＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ？
±
放线菌属 0 ± ＋＋ ＋ 0 0
（二）革兰阴性杆菌
类杆菌属 0 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
梭杆菌属 0 ＋ ＋＋ ＋ ＋ ±
普雷沃菌属 0 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋
紫单胞菌属 0 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋
（三）革兰阳性球菌
消化球菌属 ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ± ＋＋
消化链球菌属 ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ± ＋＋
（四）革兰阴性球菌
韦荣菌属 0 ＋ ＋ ＋ ± ＋
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2.外源性感染
梭状芽胞杆菌属引起的感染，其细菌及芽胞来源于土壤、粪便和其他外界环境。
3.内源性感染
无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。
（二）临床意义
1.厌氧菌感染的危险因素
1）组织缺氧或氧化还原电势降低。
2）机体免疫功能下降。
3）某些手术及创伤。
4）长期应用某些抗菌药物。
5）深部需氧菌感染。
2.厌氧菌感染的临床及细胞学指征
1）感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发感，是产气荚膜梭菌所引起感染的特征。
2）发生在口腔、肠道、鼻咽腔、阴道等处的感染，易发生厌氧感染。
3）深部外伤如枪伤后，以及动物咬伤后的继发感染，均可能是厌氧菌感染。
4）分泌物有恶臭或呈暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。
分泌物或脓肿有硫黄样颗粒，为放线菌感染。
5）分泌物涂片经革兰染色，镜检发现有细菌，而培养阴性者，或在液体及半固体培养基深部生长的细菌，均可能为厌氧菌感染。
6）长期应用氨基糖苷类抗生素无效的病例，可能是厌氧菌感染。
7）胃肠道手术后发生的感染。
三、厌氧菌标本的采集与送检
注意：
标本绝对不能被正常菌群所污染；
应尽量避免接触空气。
1.采集
表5-22-2不同部位标本采集法
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标本来源 收集方法
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封闭性脓肿 针管抽取
妇女生殖道 后穹窿穿刺抽取
下呼吸道分泌物 肺穿刺术
胸腔 胸腔穿刺术
窦道、子宫腔深部创伤 用静脉注射的塑料导管穿入感染部位抽吸
组织 无菌外科切开
尿道 膀胱穿刺术
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标本送到实验室，应在20～30分钟内处理完毕，不超过2h。
如不能及时接种，可将标本置室温保存。
（1）针筒运送；
（2）无菌小瓶运送；
（3）棉拭子运送；
（4）厌氧罐或厌氧袋运送。
四、厌氧菌的分离与鉴定
（一）直接镜检
根据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估计。
表5-22-3厌氧菌直接镜检初步鉴别
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菌名 革兰染色 形态及其他特征
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脆弱类杆菌 G-b 两端钝圆，着色深，中间色浅且不均匀，且有气
泡，长短不一
产黑素普雷沃菌 G-b 多形性，长短不一，有浓染和空泡，无鞭毛和芽
胞。
标本有恶臭，琥珀味，紫外线照射发红色荧光
具核梭杆菌 G-b 菌体细长，两头尖，紫色颗粒菌体长轴成双排列，
标本有丁酸味
坏死梭杆菌 G-b 高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形
韦荣球菌 G-c 极小的革兰阴性球菌
消化链球菌 G+c 革兰阳性呈链状的小球菌
乳酸杆菌 G+b 细长，有时多形性，呈单、双、短链或栅状排列
痤疮丙酸杆菌 G+b 排列特殊呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味
双歧杆菌 G+b 多形性，有分支呈Y、V形成棒状，标本有醋酸气味
放线菌 G+b 分支呈棒状、X、Y、V或栅状，脓汁中得黄色颗粒，
有琥珀酸味
破伤风杆菌 G+b 细长、梭形或鼓槌形，有芽胞，有周鞭毛
产气荚膜梭菌 G+b 粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜
艰难梭菌 G+b 粗长杆菌，有芽胞，有鞭毛，近来发现有荚膜
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（二）分离培养
主要分初代培养和次代培养两个阶段，初代培养的一般原则是：
（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择；
（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基；
（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基；
（4）尽量保证培养基新鲜；
（5）要考虑到微需氧菌存在的可能。
1.选用适当的培养基接种
培养基的使用，应注意下列各点：
尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；
应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；
可采用预还原灭菌法制作的培养基；
液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；
培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子。
培养基的选择：
初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。
非选择培养基：
本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。
ü常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。
选择培养基：
为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。
选择培养基
培养基
细菌
KVLB血平板
产黑素类杆菌早期产生黑色素
七叶苷胆汁平板（BBE）
脆弱类杆菌
FS培养基（梭杆菌选择培养基）
梭杆菌
ES培养基（优杆菌选择培养基）
优杆菌
BS培养基（双歧杆菌选择培养基）
双歧杆菌
卵黄（EYA）及兔血平板（RBA）
产气荚膜梭菌
CCFA培养基（艰难梭菌选择培养基）
艰难梭菌
VS培养基
韦荣球菌
2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10%C02环境中培养。
3.厌氧培养法
厌氧罐培养法；气袋法；气体喷射法；厌氧手套箱培养法（迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一）；平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。
4.厌氧状态的指示：
美蓝和刃天青。
无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。
5.分离培养厌氧菌失败的原因：
①培养前未直接涂片和染色镜检；
②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；
③未用新鲜配制的培养基；
④未用选择培养基；
⑤培养基未加必要的补充物质；
⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基；
⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；
⑧催化剂失活；
⑨培养时间不足；
⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。
（三）鉴定试验
（1）形态与染色：
可为厌氧菌的鉴定提供参考依据。
（2）菌落性状：
不同的厌氧菌其菌落形态和性质不同。
（3）抗生素敏感性鉴定试验：
卡那霉素可用于梭杆菌属与类杆菌属的区分，甲硝唑用于厌氧菌与非厌氧菌的区分。
（4）生化特性：
主要包括多种糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。
（5）气液相色谱：
可以利用该技术来分析厌氧菌的终末代谢产物，已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法。
五、常见厌氧菌
（一）破伤风杆菌
1.生物学性状
（1）形态与染色：
G+，细长，有周鞭毛，无荚膜。
芽胞在菌体顶端，呈圆形，使整个细菌体呈鼓槌状。
（2）培养特性：
专性厌氧菌，在普通培养基上不易生长。
血平板：
扁平、灰白色、半透明、边缘不齐的菌落。
（3）生化反应：
本菌一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，多数菌株吲哚阳性，不还原硝酸盐，对蛋白质有微弱的消化作用。
（4）抗原构造：
本菌有菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原。
（5）抵抗力：
繁殖体的抵抗力与其他细菌相似，但芽胞体抵抗力非常强，在干燥的土壤和尘埃中可存活数十年。
2.微生物学检查
破伤风的临床表现典型，根据临床症状即可作出诊断，所以一般不做细菌学检查。
（1）特殊需要时，可从病灶处取标本涂片，革兰染色镜检。
（2）需要培养时，将标本接种疱肉培养基培养。
（3）也可进行动物试验。
3.临床意义
引起人类破伤风，对人的致病因素主要是它产生的外毒素。
毒素对中枢神经系统有特殊的亲和力。
主要症状为骨骼肌痉挛。
典型的临床症状为咀嚼肌痉挛造成的牙关紧闭、呈苦笑面容，以及颈部、躯干及四肢肌肉持续强直性痉挛导致的角弓反张，呼吸困难，终因窒息死亡。
4.治疗原则
（1）正确处理创口，包括清刨、扩创等，防止厌氧微环境。
（2）可以尽早注射破伤风抗毒素，也可同时给予类毒素。
在注射抗毒素前应做皮试。
（3）采用四环素、红霉素等进行抗感染治疗。
（二）产气荚膜梭菌
1.生物学性状
（1）形态与染色：
革兰阳性粗大杆菌，芽胞呈椭圆型，次极端。
在机体内可形成明显的荚膜。
（2）培养特性：
厌氧但不十分严格。
最适温度为45℃。
血平板：
双层溶血环。
疱肉培养基：
产生大量气体。
牛乳培养基：
分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，出现“汹涌发酵”现象。
（3）生化反应：
本菌代谢活跃，可分解多种糖类，产酸产气，能液化明胶。
（4）分型：
根据其产生的毒素，大体可将产气荚膜梭菌分成5个型别（A、B、C、D、E）对人类致病的主要为A型。
2.微生物学检查
（1）直接涂片镜检：
在创口深部取材涂片，革兰染色镜检，这是极有价值的快速诊断方法。
（2）分离培养及鉴定：
可取坏死组织制成悬液，接种血平板或疱肉培养基中，厌氧培养，取培养物涂片镜检，利用生化反应进行鉴定。
3.临床意义
致病物质：
外毒素及多种侵袭酶类，外毒素以α毒素为主，本质为卵磷脂酶；还可产生透明质酸酶、DNA酶等。
所致疾病：
可引起气性坏疽及食物中毒，也可见于工伤造成的大面积开放性骨折及软组织损伤等。
表现为局部组织剧烈胀痛，局部严重水肿，水气夹杂，触摸有捻发感，并产生恶臭。
某些A型菌株产生的肠毒素，可引起食物中毒，病人表现为腹痛、腹泻，1～2天可自愈。
4.治疗原则：
对感染局部应及时处理，包括扩创，冲洗，切除坏死组织。
尽早使用多价抗毒素血清，同时用大剂量青霉素杀灭病原菌。
青霉素为首选抗生素，万古霉素为次选抗生素。
（三）肉毒梭菌
1.生物学性状：
G+，短粗杆菌，芽胞呈椭圆型，粗于菌体，位于次极端，使细菌呈汤匙状或网球拍状。
严格厌氧，可在普通琼脂平板和血平板上生长。
根据所产生毒素的抗原性不同，肉毒梭菌可分为8个型，引起人类疾病的以A、B型最为常见。
肉毒梭菌芽胞体抵抗力很强。
肉毒毒素对酸的抵抗力比较强，但不耐热，煮沸1分钟即可被破坏。
肉毒毒素的毒性是已知最剧烈的毒素。
2.微生物学检查
（1）分离培养与鉴定：
怀疑为婴儿肉毒病的粪便中检出本菌，并证实其是否产生毒素，诊断意义较大。
（2）毒素检测：
可取培养滤液或悬液上清注射小鼠腹腔，观察动物出现的中毒证状。
3.临床意义：
主要可引起食物中毒，属单纯性毒性中毒，并非细菌感染。
胃肠症状很少见，主要表现为某些部位的肌肉麻痹，重者可死于呼吸困难与衰竭。
4.治疗原则：
尽早诊断，迅速注射A、B、E三型多价抗毒素，同时进行对症治疗。
（四）艰难梭菌
1.生物学性状
G+，粗长杆菌，有鞭毛，次极端有卵圆形芽胞。
2.微生物检验
分离培养困难，所以在临床上一般不采用分离培养病原菌的方法，可通过临床表现及细胞毒素试验阳性检测来进行诊断。
CCFA平板上形成黄色，粗糙型的菌落。
脂酶，卵磷脂酶阴性。
在紫外线照射下呈黄绿色荧光。
3.临床意义
产生A、B两种毒素，毒素A为肠毒素，可使肠壁出现炎症，细胞浸润，肠壁通透性增加，出血及坏死。
毒素B为细胞毒素，损害细胞骨架，致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞，因而导致腹泻及假膜形成。
本菌感染与大量使用抗生素有关。
4.治疗原则 及时调整或停止相关抗生素的使用，尤其是那些广谱抗生素。
可以用万古霉素加甲硝唑进行抗感染治疗。
六、无芽胞厌氧菌
（一）主要种类
1.G-厌氧杆菌有8个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要，形态呈多形性，有荚膜，生长迅速。
2.G-厌氧球菌有3个属，其中以韦荣菌属最重要，为咽喉部主要厌氧菌。
3.G+厌氧球菌有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴道，生长缓慢，培养需5～7天。
4.G+厌氧杆菌有7个属，其中以下列3个属为主：
（1）丙酸杆菌属：
小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要2～5天，以痤疮丙酸杆菌最为常见。
（2）双歧杆菌：
呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。
齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。
（3）优杆菌属：
单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼，生长缓慢，最常见的是迟钝真杆菌。
（二）微生物检验
要从感染灶深部采取标本，立即送检。
1.直接涂片镜检
观察细菌形态、染色及菌量。
2.分离培养与鉴定 分离培养是鉴定无芽胞厌氧菌感染的关键步骤。
最常用的培养基是以牛心脑浸液为基础的血平板。
证实为专性厌氧菌后，再经生化反应进行鉴定。
（三）临床意义
均为内源性感染，所致疾病有：
1.败血症 主要由脆弱类杆菌引起，其次为G+厌氧球菌。
2.中枢神经系统感染 主要由G-厌氧杆菌引起，常见脑脓肿。
3.口腔与牙齿感染 主要由消化链球菌、产黑素类杆菌等引起。
4.呼吸道感染 主要由普雷沃菌属、坏死梭杆菌、核梭杆菌、消化链球菌和脆弱类杆菌引起。
5.腹部和会阴部感染 主要由脆弱类杆菌引起。
6.女性生殖道感染 主要由消化链球菌属、普雷沃菌属和卟啉单胞菌等引起。
7.无芽胞厌氧菌尚可引起皮肤和软组织感染、心内膜炎等。
（四）治疗原则
1.正确处理感染灶，包括清洗伤口，去除坏死组织和异物、引流等。
2.合理使用抗生素进行抗感染治疗。
七、厌氧球菌
在临床标本中检出的厌氧菌约有1／4为厌氧球菌。
其中与临床有关的有革兰阳性黑色消化球菌和消化链球菌属及革兰阴性的韦荣球菌属。
（一）黑色消化球菌临床意义
黑色消化球菌通常寄生在人的体表及与外界相通的腔道中，是人体正常菌群的成员之一。
本菌可引起人体各部组织和器官的感染（肺部、腹腔、胸膜、口腔、颅内、阴道、盆腔、皮肤和软组织等）。
常与其他细菌混合感染，也可从阑尾炎、膀胱炎、腹膜炎以及产后败血症的血中分离出来。
（二）消化链球菌属临床意义
在《伯杰氏系统细菌学手册》1986年第2卷中把消化链球菌属分成厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、吲哚消化链球菌、大消化链球菌、微小消化链球菌等共9个菌种。
本菌在临床标本中以厌氧消化链球菌最常见。
产生消化链球菌则很少见。
消化链球菌可引起人体各部组织和器官的感染，又以混合感染多见。
（三）韦荣球菌属临床意义
韦荣球菌属有小韦荣球菌和产碱韦荣球菌两个种。
它们都是口腔、咽部、胃肠道及女性生殖道的正常菌群。
大多见于混合感染，致病力不强，小韦荣氏球菌常见于上呼吸道感染中，而产碱韦荣球菌则多见于肠道感染。
八、厌氧环境的指示
1.化学法 亚甲蓝指示剂或刃天青指示剂。
2.微生物法 专性需氧菌。
【例题】哪些标本不符合厌氧菌检验要求
A、血
B、咽拭子
C、深部脓肿穿刺液
D、牙周脓肿穿刺液
E、膀胱穿刺液
[答疑编号502389170101]
【正确答案】B
【例题】分离培养厌氧菌失败的原因可能是
A、厌氧装置的催化剂失活
B、标本在空气中放置过久
C、培养基不是新鲜配置
D、培养基成分不合适
E、以上均是
[答疑编号502389170102]
【正确答案】E
【例题】下列细菌除哪种外，均能产生肠毒素
A、白喉棒状杆菌
B、霍乱弧菌
C、大肠埃希菌
D、产气荚膜梭菌
E、金黄色葡萄球菌
[答疑编号502389170103]
【正确答案】A
【例题】汹涌发酵现象可鉴定
A、炭疽芽孢杆菌
B、艰难梭菌
C、肉毒梭菌
D、产气荚膜梭菌
E、破伤风梭菌
[答疑编号502389170104]
【正确答案】D
【例题】破伤风的紧急预防应注射
A、破伤风减毒活疫苗
B、破伤风类毒素
C、百白破三联疫苗
D、破伤风抗毒素
E、丙种球蛋白
[答疑编号502389170105]
【正确答案】D
【例题】在人体肠道正常菌群中占绝对优势的有
A、双歧杆菌
B、伤寒沙门菌
C、大肠杆菌
D、变形杆菌
E、无芽胞厌氧菌
[答疑编号502389170106]
【正确答案】E
【例题】引起牙周脓肿常见的病原菌
A、铜绿假单胞菌
B、表皮葡萄球菌
C、大肠埃希菌
D、消化链球菌
E、甲型溶血性链球菌
[答疑编号502389170107]
【正确答案】D
【例题】肉毒梭菌引起的食物中毒是以
A、消化系统症状为主
B、呼吸系统症状为主
C、泌尿系统症状为主
D、神经系统症状为主
E、循环系统症状为主
[答疑编号502389170108]
【正确答案】D
【例题】无芽胞厌氧菌可致疾病有
A、败血症
B、盆腔炎
C、腹部脓肿
D、牙周脓肿
E、心内膜炎
[答疑编号502389170109]
【正确答案】ABCDE
【例题】女性，44岁，因肛裂引起直肠与会阴部瘘管，取瘘管脓性分泌物直接涂片检查为革兰阴性杆菌，但未分离出病原菌
（1）应做进一步的细菌学检查是
A、标本用厌氧方法培养
B、标本用普通方法培养
C、标本用高渗培养基培养
D、标本在5%～10%二氧化碳中培养
E、标本用SS琼脂平板培养
[答疑编号502389170110]
【正确答案】A
（2）采集与送检标本时应注意
A、室温放置一段时间后再接种培养基
B、冰箱放置一段时间后再接种培养基
C、立即放入厌氧标本收集瓶中，迅速送检
D、37℃放置一段时间后再接种厌氧培养基
E、22℃放置一段时间后再接种厌氧培养基
[答疑编号502389170111]
【正确答案】C
（3）标本最适合接种的培养基是
A、巧克力琼脂平板
B、含牛心脑浸液的血平板
C、沙保弱培养基
D、碱性蛋白胨水培养基
E、尿素培养
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