第十二章 体外实验与生物技术在毒理学中的应用.docx
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第十二章体外实验与生物技术在毒理学中的应用
第十二章体外试验与生物新技术
在毒理学中的应用
第一节体外试验
毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。
过去利用整体实验动物模型或称体内试验（invivotest）模型所提供的资料，判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。
体外试验模型（invitrotest）在上述过程中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。
但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍占主导地位。
目前，此种观点已发生变化，因为：
①全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。
而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。
在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。
解决此种问题的重要方向是体外试验。
②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。
③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。
④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。
所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。
但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。
一、概述
（一）分类
毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。
在有些情况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。
在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。
了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的地位极有帮助。
可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：
①筛选试验。
它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。
②附加试验。
它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。
③替代试验。
它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。
（二）基本原理
体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。
如将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。
基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或DNA分子等等。
（三）体外试验的优缺点
体外毒性试验的优点可归纳在表12—1。
表12-1体外毒性试验系统的优点
能控制环境因素
可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响
每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等
试验间的误差较少
可同时和／或反复多次取样
可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等
较为快速和经济
需要较小量的受试化合物
产生较小量的有毒废物
可以利用人体细胞
减少整体动物的使用
其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。
体外毒性试验结果可迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到产品进人市场的时间过程。
此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发，减少由资源到产品的投入。
在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。
但毒理学试验的目的是关心人类健康，目前主要是将动物试验结果外推至人类，物种间差异为其不确定因素之一。
在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。
体外毒性试验系统的利用在目前尚有不足之处：
①体外到体内外推的问题。
体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。
它需要更好的工具——预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。
另一方面，体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素，如细胞与组织的修复过程和免疫系统的不同类型细胞间的相互影响等。
假如有了更全面的毒理学过程的基础知识，可设计更符合整体动物模型的体外系统。
但现阶段毒理学作为一个学科的发展尚缺少许多重要的资料。
②体外毒性试验难以预测慢性毒性。
因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。
二、体外试验系统
（一）脏器灌流
1.肝脏灌流是毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。
在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。
一般是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。
有报道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氢取代衍生物三氯甲烷与二氯甲烷对肝脏毒性，结果发现随着灌流时间延长（在4h之内），灌流液的上清液中K+、谷丙转氨酶（SCPT）、山梨醇脱氢酶（SDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）增加，说明三种化合物对肝细胞均有损伤，而以四氯化碳为最，且依氯原子被氢取代肝毒减低。
需指出肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细胞的功能与生存不能维持。
2.肠灌流利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。
如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。
例如有人研究锌的吸收及其影响因素，以大鼠回肠段为标本，证实锌吸收呈二室模型（肠腔为Ⅰ室、肠粘膜为Ⅱ室），苯丙氨酸能增加肠腔与肠粘膜之间锌的交换，且加速向血流的清除过程。
3.膈肌-膈神经标本取完整的大鼠膈肌-膈神经置于恒温灌流液中，，在几小时之内可维持基本正常的神经肌肉传导。
这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。
（二）脏器切片
肝脏、肾脏、脑部及心均可以制备切片。
例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的孵育液中进行有关试验研究，但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交流。
切片厚度一般在250μm。
不同研究期间有别，如肝切片研究CytP-450不应超过8h，脑切片一般在6h左右。
此系统的优点是保持了细胞之间的结构，其操作也比脏器灌流容易。
不足之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。
（三）原代细胞培养
1.肝细胞原代培养肝细胞尚未建成传代的细胞株系，多用原代培养。
肝细胞原代培养期间细胞不分裂、不增殖，但发现基因转录是存在的（培养初期24h在1％或以上）。
细胞原代培养维持生存期1～2周，但是CytP-450却在24～28h活性减少50％左右。
据报道人肝细胞中CytP-450活性稳定性比大鼠强。
利用原代培养的肝细胞可以进行多种毒理学研究。
如研究化学物的肝脏毒性，一般认为，用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠，与体内试验相符合。
有报道以肝细胞损伤后某些酶释放为指征，研究30个化学物，结果除少数化学物在肝细胞培养中表现毒性比体内试验低之外，多数化学物内外毒性符合一致。
在体外试验表现毒性较低的化学物有环已酰胺（cycloheximiole）、溴苯（bromobenzene）和长春新碱（vincristine）等。
2.巨噬细胞豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法获取肺巨噬细胞，小鼠可用腹腔灌洗获得腹腔巨噬细胞，甚至人也可通过肺灌洗得到。
巨噬细胞可以用于多种体外试验，例如利用巨噬细胞的免疫功能检测外源化学物的免疫毒性，又如利用巨噬细胞检测以肺脏为毒理学终点的外源化学物的中毒毒性和机理。
关于后者，有人利用豚鼠肺巨噬细胞原代培养纯化后，研究二氧化硅（silica，SiO2）致矽肺的机理。
3.淋巴细胞多用小动脉脾脏分离淋巴细胞或进一步分离T、B淋巴细胞进行免疫毒理研究。
例如研究镉的免疫毒性，证明镉可以抑制淋巴细胞转化和抑制白细胞介素-2的产生，且在一定条件下使淋巴细胞内游离钙浓度增加及钙调素（CaM）活性降低，此为镉的免疫毒性机理研究提供了线索。
4.脑细胞分离的新鲜脑细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其机理如用小鼠大脑皮质分离、温育后，研究二价阳离子钙、镁、锌、镉等对皮层神经细胞的损伤，发现这些离子随着浓度的增加，脑神经细胞的电泳迁移率逐渐减慢。
随着脑细胞技术的发展，还可在温育体系中存在外源化学物情况下，用微电极插入脑细胞，通过电信号的变化，更深入地研究外源化学物对神经细胞的功能损伤。
5.心肌细胞心肌细胞用于毒理学研究的报道目前还较少。
用新生1～2日龄大鼠心室肌分离心肌细胞，原代培养4天后，将微电极（直径<0.5um）插入细胞内，研究镉对心肌的影响。
经记录、分析各心肌细胞动作电位参数，结果镉在5～20μmol／L浓度下，可使心肌细胞动作电位及最大除极速率显著降低，表明镉对心肌有直接的毒性效应。
此外，将分离的心肌细胞于培养的24~48h期间，利用膜片钳的连细胞电压钳法，描记心肌细胞上的B型、L型及T型3种Ca2＋通道的单通道活动。
当在培养液中加入10μmol／L氯化镉之后，B型通道开放时间缩短1／3、关闭时间延长45.1％、通道开放概率下降55％，L型通道开放时间缩短40.7％、关闭时间延长23.1％、通道开放概率下降50％，而对T型通道无影响。
进一步证实镉对心肌有毒性效应。
（四）细胞培养
有些脏器细胞建立了传代培养技术，建成有稳定遗传特征的细胞株系。
有的利用细胞培养技术建立了特殊的试验方法。
1.肾细胞由于肾小管，尤其是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。
例如1926年Hull等人选育传代培养的LLC-PK1细胞是来源于Hampshire猪。
据报道此株系细胞的各种生物学特征已进行了相当深入的研究（包括激素应答反应、物质转运特征、细胞的代谢功能和标志等）。
此后又建立了从鼬（opossum）获得的OK株系、从兔获得的RC-SVI株系。
近年国内利用300次传代培养的LLC—PKl细胞系对铅的肾毒进行了研究，包括铅对细胞的损伤、对细胞膜脂流动性的影响、对细胞膜相变温度的影响、脂质过氧化效应、胞内钙浓度变化及形态学改变等，这对铅的肾脏毒性机理提供了依据。
2.胚胎细胞利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。
例如我国用人胚肺纤维母细胞传代培养人胚肺二倍体细胞，已建立了以2BS为代表的株系。
此株系在用于筛检致癌物方面做了一些工作。
如人胚肺二倍体细胞在10-7～10-8mol／L苯并（a）芘长达28～38代传代培养下，电镜镜检发现细胞核外形不规则、核膜深陷、出现细桥（tinybridge）伴分叶核形成、核内胞浆包涵体、核仁巨大或多核等细胞癌变特征。
此外，人胚主动脉平滑肌细胞也可作为标本传代培养研究金属的毒理。
近十年来，毒理学相继引入啮齿类动物的着床前全胚胎培养技术（pre-implantatationwholeembryoculture）、着床后全胚胎培养技术（post-implantationwholeembryoculture），以及器官培养如腭板培养、胚胎枝芽体外培养等筛检致畸化学物均取得一些成果。
（五）组织匀浆
取脏器除血污制备组织匀浆，是用物理学方法使细胞壁破坏，细胞组成成分与细胞间质混合形成混悬液。
利用匀浆为标本主要是研究外源化学物对细胞酶系统的毒理作用。
最常使用的是脑匀浆、肝匀浆，虽然肺、肾、肠等脏器也可制备匀浆，但是因纤维结缔组织或肌细胞不易破碎影响匀浆的质量。
文献中有机磷化合物对神经系统Ache抑制的强度及特征，大量工作是通过以脑匀浆为标本，主要是以哺乳动物、啮齿类和昆虫的脑完成的。
不少外源化学物的代谢和以肝脏为靶器官的外源化学物的毒性效应特征与机理是通过肝匀浆进行的。
现虽然不少工作已为其它技术所取代，但是应用匀浆作为过筛与初步研究还是有用的，主要因其制备方法简单、制备周期很短，且不需复杂的设备。
（六）亚细胞组分
将细胞中各亚细胞组分分离和纯化，对于深入研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒性效应的机理均十分重要。
它较组织匀浆优越，排除了匀浆中其它因素的影响。
现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。
1.细胞膜人与动物红细胞分离后低渗溶血，高速低温离心可制得红细胞膜（或称血影，ghost）。
血影为常用的细胞膜标本。
此外肺巨噬细胞、肺细胞、突触小体等均可制备膜标本（先将细胞匀浆破膜，低温差速离心、梯度离心制备）。
使用细胞膜可以进行很多的毒理试验，尤其是在探讨化学物中毒机理方面。
以红细胞膜为例，用人工细胞为标本与0.1mmol／L铅作用仅5min，红细胞膜远紫外色谱就出现改变，表明膜蛋白的构象发生了变化。
神经末梢断裂脱落的突触体（synaptosome）具有类似完整细胞的功能，除可利用突触体作为标本外，还可进一步制备突触体膜（synaptosomemembrane）。
实验表明对硫磷在5×10-9mol／L水平即可抑制突触体的摄钙功能，并引起突触体膜脂流动性下降。
近年来为纯化实验条件，以利于从分子水平研究外源化学物的毒效应机理，已将人工膜引入毒理学研究。
所谓人工膜，即是以正常细胞膜的膜脂组分，人工合成后用之在—定介质中形成人工膜。
2.微粒体（microsome）尤其是肝细胞制备的微粒体常作为毒理学研究的标本，这是由于肝脏代谢酶系主要存在于肝细胞内质网，即肝细胞的亚细胞组分分离后的微粒体中。
有报道TNT在无氧而加人NADPH环境下与微粒体温育，用ESR波谱仪检测出硝基阴离子自由基（Ar-NO2￣）；而在有氧环境中能迅速与分子氧反应生成硝基化合物与超氧阴离子（O2）。
3.线粒体（mitochondria）它是细胞中进行呼吸作用的主要场所。
据报道溴氰菊酯（decamethin）在体外试验中，对线粒体呼吸功能有明显抑制作用。
又据报道镉对大鼠肝细胞线粒体Ca2+-ATPase有抑制作用，且使线粒体膜脂流动性下降。
（七）酶
外源化学物对机体的毒性效应，往往表现某种或某些酶的活性变化上，即可以利用标志酶活性的变化反映化学物所损伤的靶器官。
在体外毒理学中则主要是定量研究外源化学物对靶酶作用的特征、性质和机理。
此类研究的基础工作是纯化酶，如获得纯化酶，可在体外精确地控制各种因素，对纯化酶作用的体征、性质和机理进行研究，如细胞色素P-450重组系统。
由于酶的提纯技术复杂，故而在一般毒理学研究中多用脏器匀浆和亚细胞组分作为酶源。
虽然这些酶源标本含有多酶成分，但是只要测定酶活性的条件适宜，完全可以得到良好的结果。
有报道金属离子Cd2+、Hg2+、Pb2+对一些钙调素依赖酶就具有双向效应，即在低浓度时可以激活这些酶，而高浓度时又可抑制酶的活性。
文献中早已证明有机磷化合物的主要靶酶是AChE。
经酶动力学分析，有机磷化合物与AChE底物ACh呈竞争性；即有机磷化合物对AChE为竞争性的不可逆性抑制物。
但是不同结构的有机磷化合物对AChE的亲合力可有很大差别。
第二节哺乳动物细胞制备和培养
一、概述
到目前为止，分离的细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。
体外系统分离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养的细胞。
在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统日渐广泛，造成这种趋势的原因有三：
一是来自公众要求减少实验中使用动物数量的压力；二是非整体动物实验可显著地减少常规整体动物实验所需的高额费用；三是人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺乏。
利用细胞，可更严格控制实验条件，有效地研究毒性作用的生化机理。
表12-2详细列出细胞在毒理学中应用的优缺点。
表12-2体外系统——细胞在毒理学中应用的优、缺点
优点改善效率，减少费用
使用实验动物较少
仅需少量的受试物
较大程度控制细胞族的性状
直接控制胞外基质、化学物浓度及接触时间
排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫系统的影响
可从同一实验体系重复取样
缺点缺少整个器官的形态学观察
选择性丧失整体器官特异性功能，如毒性代谢酶的丧失
缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统，
一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物的逐渐累积。
多为短期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大
表12-3毒理学研究中常用细胞
各种物种的成纤维细胞
淋巴母细胞
腹水瘤细胞
淋巴细胞
角质细胞
肝细胞
肝癌细胞
肾脏髓质和皮质细胞
肺的各种类型细胞
培养的背根胶质细胞
培养的睾丸细胞
膀胱细胞
心脏细胞
脊髓微血管细胞
脂肪细胞
由于哺乳细胞作为体外实验系统的优越性，在毒理学中，已有许多不同类型细胞应用于毒理学实验。
表12-3为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。
利用哺乳动物细胞进行毒理学体外实验有两种方法：
一是建立正在迅速生长的细胞株，用以观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用；二是利用已高度分化的细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊毒作用；
二、基本技术
（一）仪器与设备
1.培养箱一般来说，在5％CO2，95％空气和99％的相对湿度的条件下，许多细胞可存活。
故细胞培养的关键设备是CO2培养箱。
其基本要求：
①精确地温度控制调节，一般在土0.5℃，箱内温度的均衡可依赖风扇；②CO2浓度调节，利用CO2传感器监测箱内CO2浓度；使箱内大气为5％CO2，95％空气；③箱内湿度，可用水盘来维持。
有的细胞培养可以不控制CO2分压。
例如，原代肝细胞培养，可用LeibovitzL-5介质，不需CO2，而要求敞开培养瓶，以供给较高的O2分压。
2.冰箱和冷柜冰箱（4℃）用于存放培养介质，冷柜（—20℃）则存放酶，（如胰蛋白酶）和某些培养介质如谷氨酸和血清。
3.显微镜最基本的配置是一台简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以便依据细胞生长状况，进行调整或对污染进行补救或处理。
进行进一步的研究，则需要更高级的显微镜，例如，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。
4.超净工作台在没有无菌操作室的条件下；可用超净工作台。
它是一无菌操作装置，主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无菌环境。
它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘过多对净化作用不利，故超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。
5.清洗和消毒设置：
培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求温度160℃以上，最好使用较大规格的干燥箱，如650×500×500mm。
器皿的清洗可用超声波洗涤器。
吸管的清洗采用虹吸原理制成的冲洗装置。
金属器械如解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。
6.培养器皿为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。
特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。
主要的塑料瓶皿有；①多孔培养板，其规格有4孔、6孔、24孔及96孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；②培养皿，规格有直径30mm、60mm及l00mm，与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转化等试验；③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有30ml、50ml、l00ml及500ml，适于在CO2培养箱中使用；④其它：
冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，后者的规格有200~1000μ1和1μl~100μl二种。
玻璃器皿在实验室仍不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：
①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有l0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各种培养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有500ml、250ml和l00ml；
③离心管，规格有50ml、l0ml和5ml，用于细胞洗涤。
7.液氮贮存器贮存细胞多用液氮，液氮温度在-196℃，具有经济、省力和能较好保持细胞生物学特性的优点。
液氮贮存器有25L和50L两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氮。
如有需要可配置贮存器和运输瓶。
8.水纯化装置细胞培养对水的要求较高，通常要求使用三次蒸馏水配制各种培养液。
对玻璃器皿也应用纯水清洗。
但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地去除有机物。
实验室应配备自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器，具有蒸馏速度快，使用安全等优点。
外购蒸馏水或去离子，应在本实验室重蒸后使用。
对水质量应经常检测，如pH和电导系数。
同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。
9.滤过消毒装置培养介质不能经高压蒸汽消毒，而需通过孔径为0.22μl的滤膜过滤消毒。
滤过消毒装置由抽气泵（水流玻璃抽气泵或真空泵）、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。
10.一般设备
离心机，用于对细胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等。
天平，包括普通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化液及生理盐水等。
酸度计，用于准确调整各种介质及生理盐水的pH。
电磁搅拌器，微量加样器等。
（二）培养用液
指细胞培养中所使用的溶液，如培养液、消化液、pH调整液、染液及细胞洗涤液等。
培养液的选择取决于细胞生长的要求，故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液，它的主要成分为平衡盐溶液和适应细胞体外培养的各种溶液。
培养液在制备过程中应严格操作，避免混入杂质。
应特别注意下列问题：
①容器，应仔细认真清洗，必要时须消毒；②水，三次重蒸蒸馏水；③严格选择品质优良的药品；④制备好的培养介质要标明名称、配制日期及配制者；⑤贮存与消毒。
1.平衡盐溶液常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸盐缓冲液（PBS）等。
它具有维持渗透压、控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。
它是配制各种培养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。
2.小牛血清是细胞培养中最常见的天然培养基，它具有丰富的营养物质，对细胞附着和保护也有明显的作用。
但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不足。
弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。
天然培养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。
3.合成培养基系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。
如最简单的MEM
Eagle培养液，包括12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素。
根据需要可添加某些成分，如碳水化合物（葡萄糖、核糖、脱氧核糖及丙酮酸钠等）、核酸的前体物（嘌呤和嘧啶类化合物）及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。
如进行无血清培养，除上述营养成分外，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成分以促进细胞贴壁。
有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。
为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。
常用抗生素有青霉素、链霉素及庆大霉素等。
4.消化液进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞，通常使用消化液。
常用的消化液有胰蛋白溶液（0.25％或0.125％）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶液（0.02％）。
5.其它pH调整液
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